Séquençage V(D)J unicellulaire à haut débit : Introduction, principe et flux de travail

Diversité et mécanismes moléculaires de l'immunité spécifique

Le système immunitaire est divisé en immunité non spécifique et immunité spécifique selon qu'elle est "ciblée" sur le "non-soi" ou non. La base moléculaire du ciblage de l'immunité spécifique est assumée par les molécules de récepteur immunitaire des cellules T/cellules B (TCR/BCR) exprimées à la surface des lymphocytes T/B, et un "non-soi" correspond à un TCR ou BCR.

Il existe d'innombrables agents pathogènes dans la nature, mais les cellules humaines n'ont qu'environ 25 000 gènes, alors comment répondent-elles au besoin de Diversité TCR/BCRLa réponse est liée au degré élevé de réarrangement des gènes codant pour le TCR/BCR.

La recombinaison VDJ dans le système immunitaire. (Kaeser et al. 2020)

Les régions hautement variables dans la molécule TCR/BCR sont codées par des combinaisons de gènes V, D et J, et une grande variété de TCR/BCR est générée grâce à des réarrangements géniques complexes tels que des combinaisons modulaires de permutations et de mutations. Dans le BCR, par exemple, il existe environ 40 modules V différents, 25 modules D différents et 6 modules J différents dans le gène humain. Les cellules B sélectionnent l'un des modules de gènes V, D, J et C, respectivement, et les assemblent pour créer un gène codant pour un BCR mature, ce qui donne 2400 combinaisons.

De même, les cellules T subissent un réarrangement génétique pour générer une diversité. TCRsCependant, le processus de réarrangement des gènes TCR implique la sélection et le réarrangement des segments de gènes variables (V), de jonction (J) et constants (C). La combinaison de différents segments de gènes V et J contribue à la diversité des TCR.

Veuillez vous référer à notre article. Aperçu de la stratégie pour le profilage des TCR basé sur le séquençage de nouvelle génération pour des informations détaillées.

En ce qui concerne les différences dans la réponse au nouveau coronavirus (SARS-CoV-2), la variabilité des TCR et des BCR parmi les individus peut contribuer aux variations des réponses immunitaires. Certaines personnes peuvent avoir des TCR et des BCR mieux adaptés pour reconnaître et combattre le virus, ce qui entraîne une infection plus légère ou asymptomatique. À l'inverse, les individus ayant des TCR et des BCR moins efficaces pour reconnaître le virus peuvent éprouver une maladie plus sévère.

Pour acquérir une compréhension plus approfondie des types et des différences quantitatives des molécules TCR et BCR dans les réponses immunitaires, les chercheurs peuvent utiliser le séquençage V(D)J à cellule unique à haut débit. Cette technologie permet l'analyse de cellules T ou B individuelles, fournissant des informations sur la diversité et la composition du répertoire immunitaire à un niveau de cellule unique. De telles études peuvent contribuer à notre compréhension des réponses immunitaires aux infections, aux maladies auto-immunes et à d'autres troubles liés au système immunitaire.

Introduction de la technologie de séquençage V(D)J à cellule unique

Cellule unique à haut débit Séquençage V(D)J La technologie est capable de capturer l'ARNm de milliers de cellules individuelles à la fois au niveau de la cellule unique, et d'obtenir des informations sur l'expression des gènes V(D)J pour chaque lymphocyte T et lymphocyte B tout en obtenant le profil d'expression génique complet de chaque cellule.

Pour répondre aux besoins de "haut débit" et de "cellule unique", le séquençage V(D)J de cellule unique à haut débit est principalement réalisé en utilisant des puces microfluidiques à gouttelettes et des microsphères avec des étiquettes moléculaires.

Une suspension de cellules uniques obtenue par dissociation d'échantillons, des microsphères étiquetées moléculairement, un kit de transcription inverse et de l'huile de génération de gouttelettes sont ajoutés aux puits contaminés de la puce microfluidique à gouttelettes.

En contrôlant le débit des microsphères, des cellules et des réactifs dans le canal d'écoulement microfluidique, les microsphères, les cellules et les réactifs peuvent être associés dans le rapport souhaité et finalement entrer dans la phase huileuse à travers la phase aqueuse, ce qui peut enfermer les cellules et les microsphères dans l'huile dans l'eau, formant ainsi un état de cellule unique.

Après que les cellules entrent dans l'huile dans l'eau, la membrane cellulaire se rompt pour libérer des molécules d'ARNm. Les molécules d'ARNm sont capturées par des structures telles que polyT ou C-C-C à l'extrémité des millions d'oligonucléotides simples brins portés sur les microsphères. Chaque oligo porte à la fois un code-barres cellulaire et une étiquette de transcript (codes-barres moléculaires), de sorte que même si des dizaines de milliers de cellules sont mélangées pour des expériences ultérieures de transcription inverse et de construction de bibliothèque, les données de la bibliothèque peuvent toujours être réparties à chaque cellule et restaurées au véritable niveau d'expression génique en utilisant le code-barres cellulaire et les codes-barres moléculaires lors de l'étape d'analyse des données.

Veuillez lire notre article. Séquençage du répertoire immunitaire : Introduction, flux de travail et applications pour plus d'informations.

Flux de travail du séquençage V(D)J à cellule unique

Le séquençage V(D)J à haut débit des cellules uniques nécessite également la dissociation des échantillons de tissu en suspensions de cellules uniques, suivie de la formation de structures eau-dans-huile avec des puces microfluidiques pour compléter la séparation des cellules uniques, suivie de la capture des acides nucléiques et de la construction de bibliothèques de transcriptomes et de bibliothèques TCR/BCR.

Séquençage massivement parallèle des récepteurs B à cellule unique. (Goldstein et al., 2019)

Les principales étapes de l'isolement des cellules à la construction de la bibliothèque sont les suivantes :

Étape 1 : Dans la structure eau-dans-huile, la membrane cellulaire est dissoute pour libérer les molécules d'ARNm intracellulaires.

Étape 2 : Les molécules d'ARNm sont synthétisées en cDNA simple brin par la transcriptase inverse. Les molécules de cDNA sont capturées par des oligonucléotides avec un code-barres cellulaire, et sont ensuite synthétisées en molécules d'ADN double brin. Dans ce processus, chaque molécule d'ADN est marquée avec une étiquette cellulaire.

Étape 3 : Prenez certaines de ces molécules d'ADNc double brin pour compléter la construction et le séquençage d'une bibliothèque de transcriptome de profil d'expression génique entière (les molécules d'ADNc provenant de toutes les cellules sont mélangées dans ce processus pour construire une bibliothèque hybride multicellulaire).

Étape 4 : Prenez certaines des molécules de cDNA double brin et complétez la construction de la bibliothèque V(D)J et le séquençage en combinant les amorces de la région conservée du gène V(D)J (toutes les molécules de cDNA des cellules sont mélangées ensemble dans ce processus pour construire une bibliothèque hybride multicellulaire).

Dans la phase d'analyse des données qui suit, la bibliothèque de transcriptome et la bibliothèque V(D)J peuvent être réduites au niveau des cellules uniques en fonction des étiquettes cellulaires, ce qui permet de comprendre le profil d'expression génique et les informations d'expression des gènes V(D)J de chaque cellule. Le profil d'expression génique complet de chaque cellule, combiné avec des gènes marqueurs spécifiquement exprimés dans différents types cellulaires, permet l'annotation cellulaire de chaque cellule pour comprendre les types de cellules présents dans chaque échantillon, le nombre de chaque cellule et l'expression génique de chaque cellule. En combinaison avec la bibliothèque V(D)J, il est possible de savoir quel gène V(D)J est exprimé dans chaque lymphocyte T ou B et quel molécule TCR/BCR y correspond.

Références :

1. Kaeser, Gwendolyn, et Jerold Chun. "Recombinaison génique somatique des cellules cérébrales et ses fondements phylogénétiques." Journal de la chimie biologique 295,36 (2020) : 12786-12795.
2. Goldstein, Leonard D., et al. "Le séquençage massivement parallèle des récepteurs B à cellule unique permet la découverte rapide d'anticorps réactifs à des antigènes divers." Biologie des communications 2.1 (2019) : 304.