Séquençage du répertoire immunitaire

Qu'est-ce que le répertoire immunitaire ?

Le système immunitaire adaptatif joue un rôle extrêmement important dans la lutte contre les agents pathogènes infectieux et la protection du corps humain. La base du système immunitaire adaptatif repose fondamentalement sur l'énorme diversité des récepteurs des cellules T et d'autres récepteurs immunitaires capables de reconnaître des épitopes provenant d'un nombre astronomique d'antigènes exogènes différents et de facteurs endogènes de l'hôte.

Le répertoire immunitaire est connu comme la collection de cellules immunitaires fonctionnellement diverses dans le système circulatoire, qui est une mesure clé de la complexité immunologique. Les cellules T et d'autres cellules immunitaires orchestrent respectivement les réponses immunitaires cellulaires et humorales dans l'organisme. Chacune fonctionne via ses récepteurs de surface pour reconnaître et se lier aux antigènes, jouant un rôle critique dans l'élimination des pathogènes ou des cellules tumorales intrabodiques. Opérant indépendamment, les cellules T et ces autres cellules immunitaires médiatisent les réponses immunitaires cellulaires et humorales complémentaires du corps, chacune utilisant ses récepteurs spécifiques à sa surface. Ces récepteurs facilitent l'identification et la liaison aux antigènes, jouant ainsi un rôle fondamental dans l'élimination des pathogènes ou des cellules tumorales endogènes. L'étude du répertoire immunitaire est cruciale pour comprendre la réponse de l'immunité adaptative et, en fin de compte, éclaire la découverte de nouveaux agents infectieux et possède un potentiel inestimable pour aider au développement d'anticorps ou de vaccins, au diagnostic clinique, au traitement et à la prévention.

Si vous souhaitez en savoir plus sur l'introduction du séquençage du répertoire immunitaire, veuillez consulter notre article "Séquençage du répertoire immunitaire : Introduction, flux de travail et applications.

Séquençage à haut débit du répertoire immunitaire

Les stratégies traditionnelles pour étudier le répertoire immunitaire, qui incluent le spectratypage, Séquençage de Sanger et al., sont laborieux, coûteux et insuffisants pour générer une image haute résolution du répertoire immunitaire. NGS (séquençage de nouvelle génération) offre une approche puissante capable d'analyser le répertoire immunitaire de manière à haut débit. En fournissant d'énormes données de séquençage, NGS a créé une image d'une résolution sans précédent du répertoire immunitaire, qui offre un grand potentiel pour révéler les changements dynamiques dans les populations clonales lors de la stimulation antigénique.

Séquençage du répertoire immunitaire - Régions cibles

Dans le domaine du séquençage du répertoire immunitaire, l'accent est mis sur les lymphocytes T/B. En utilisant des techniques telles que la PCR multiplex ou le 5'RACE, l'objectif est d'amplifier les régions déterminantes complémentaires (CDR3) qui déterminent la diversité des récepteurs des cellules B ou Récepteurs des cellules TLe CDR3, étant la région la plus variable, se positionne comme l'épicentre de l'exploration dans les études de séquençage du répertoire immunitaire. Sa prééminence est soulignée par son statut de domaine le plus largement étudié dans ce domaine.

Figure 1. Structure de l'IgG (Brian Douglas Weitzner 2015)

Qu'est-ce que le séquençage BCR ?

Le séquençage BCR utilise séquençage à haut débit pour détecter l'amplification ciblée des chaînes lourdes et légères des BCR. Elle analyse de manière exhaustive les séquences de base résultant des réarrangements géniques des BCR, ainsi que l'abondance de chaque séquence. Cette technique trouve son application dans l'étude des profils transcriptionnels et des interrelations de différents clones de cellules B, explorant la spécificité fonctionnelle des cellules B. Par conséquent, elle aide à élucider des phénomènes tels que la tolérance de la réponse immunitaire humorale et le rôle des mutations à haute fréquence dans la reconnaissance anormale des antigènes par les cellules B.

Les applications du BCR-Seq englobent:

• Dépistage des mutations somatiques dans les populations cellulaires de patients atteints de maladies immunodéficientes primaires comme la déficience isolée en IgA.
• Guidage du traitement des maladies auto-immunes (par exemple, lupus érythémateux systémique, sclérose en plaques, diabète de type 1) et suivi de la progression de la maladie pendant le traitement.
• Évaluation de l'efficacité et de la tolérance des traitements médicamenteux pour les maladies infectieuses et les tumeurs malignes.
• Prédire et intervenir dans les réactions de rejet de greffe, en fournissant des conseils sur la tolérance et les réponses au rejet.

Qu'est-ce que le séquençage TCR ?

Séquençage des récepteurs des cellules T (TCR-Seq) utilise séquençage à haut débit (HTS) pour détecter l'amplification ciblée des molécules de surface déterminantes de la reconnaissance des antigènes par les cellules T. Il analyse leur diversité, ainsi que les séquences de base de réarrangement des gènes TCR et l'abondance de chaque séquence avant et après la reconnaissance des antigènes par les cellules T. Cette technique reflète les changements dans la réponse immunitaire cellulaire médiée par les cellules T dans des états physiologiques et pathologiques. Elle est essentielle pour étudier les profils transcriptionnels et les interrelations de différents clones de cellules T, dévoilant ainsi des niveaux plus profonds de spécificité fonctionnelle des cellules T.

Les applications du TCR-Seq incluent:

• Détection et suivi de la surveillance et du traitement post-immunothérapie tumorale.
• Évaluation de l'efficacité et de la tolérance de l'immunothérapie anti-infectieuse.
• Prédiction et orientation des rejets aigus dans les réactions de rejet de greffe.
• Essais cliniques et recherches scientifiques sur les maladies auto-immunes.
• Biomarqueurs et diagnostics pour diverses maladies infectieuses et neuroplastiques.

Service de séquençage TCR

CD Genomics a développé des avancées TCR Stratégie de séquençage pour amplifier et séquencer le répertoire immunitaire avec le séquençage de nouvelle génération (NGS). Nous proposons désormais une solution complète pour évaluer la diversité du répertoire immunitaire de manière précise et rentable en regroupant les échantillons. Nous pouvons adapter la construction de bibliothèques et les protocoles de séquençage pour répondre aux exigences spécifiques de différents types d'échantillons et projets de recherche, garantissant une approche personnalisée pour nos clients. De plus, nous intégrons des algorithmes bioinformatiques de pointe pour faciliter l'analyse visuelle des données, en nous alignant sur les normes mondiales en biologie computationnelle.

Notre stratégie de séquençage du répertoire immunitaire consiste à capturer la région déterminante complémentaire (CDR) du récepteur des cellules T (TCR) en utilisant des méthodes de PCR multiple ou de RACE 5', suivies d'un séquençage profond. Le flux de travail pour cette stratégie est illustré dans la figure ci-dessous.
La construction réussie de bibliothèques de TCR peut être réalisée en utilisant des échantillons obtenus par tri magnétique immunologique des cellules T positives pour CD3 et séparation par centrifugation sur gradient de Ficoll-Paque des lymphocytes sanguins périphériques.

Figure 2. Schémas des étapes pour le séquençage à haut débit du répertoire de séquences d'Ig (Georgiou et al., 2014).

Sélection de deux techniques de PCR

Remarque : Choisissez différentes plateformes de séquençage et modes en fonction des besoins variés.

Quels sont les avantages de notre séquençage du répertoire immunitaire ?

• Service complet et intégré : Nous proposons des services professionnels couvrant l'ensemble du processus, de la conception expérimentale, l'extraction et l'amplification des acides nucléiques, la construction de bibliothèques, le séquençage, l'analyse des informations, jusqu'à l'exploration des données.
• Techniques d'amplification de pointe : En utilisant la PCR multiplex ou la technologie 5'RACE, nous employons des amorces optimisées par des ajustements de plasmides, réduisant considérablement les biais et atteignant une amplification équivalente pour divers clones.
• Haute reproductibilité : Haute cohérence des clones lorsque le même échantillon est préparé en bibliothèque deux fois.
• Quantification clonale plus précise : Alignement des lectures de faible qualité avec des clones de haute qualité pour récupérer des données importantes, garantissant aucune perte d'informations sur la quantification clonale.
• Correction d'erreurs améliorée et gestion des incohérences : utilisation de méthodes de clustering multi-niveaux pour corriger les erreurs introduites par la PCR et le séquençage.

Quelles sont les applications du séquençage du répertoire immunitaire ?

• Thérapie des tumeursIl existe des recherches sur l'infiltration des lymphocytes présents dans divers types de tumeurs (y compris le cancer colorectal, ovarien, du foie et le mélanome), suivant les changements dans le microenvironnement immunologique au début de la formation tumorale. Cela aide à identifier des cibles pour l'immunothérapie et à renforcer ainsi la réponse anti-tumorale et l'efficacité de ces traitements.
• Transplantation et reconstitution immunitaireLors de la transplantation d'organes ou de moelle osseuse, il y a souvent induction d'une réponse de rejet de l'hôte qui peut conduire à une maladie du greffon contre l'hôte chronique. À ces moments-là, la technologie de séquençage des immunoglobulines peut être utilisée pour explorer le répertoire des lymphocytes T post-transplantation, facilitant ainsi l'identification des groupes à haut risque d'infection postopératoire et de rechutes.
• Maladies auto-immunesLes chercheurs analysent des cellules immunitaires exprimées de manière aberrante (cellules T ou anticorps) et découvrent ainsi des biomarqueurs diagnostiques. La quête de biomarqueurs dépassant les normes actuelles et l'exploration des mécanismes immunologiques liés à l'auto-immunité peuvent donc fournir une base substantielle pour le diagnostic et le traitement des maladies.
• Évaluation des médicaments et des vaccinsÉvaluation des échantillons de sang périphérique après médication pour la maladie, vérifie si le médicament déclenche une réponse immunitaire et son efficacité.
• Autres aspectsLes bibliothèques d'immunoglobulines jouent un rôle essentiel dans l'étude des maladies infectieuses, le traçage des spectres immunitaires différentiels et les recherches liées aux modalités immunothérapeutiques.

Flux de travail de séquençage du répertoire immunitaire

Spécification de service

	Exigences d'échantillon T cellules triées ARN/PBMCs ARN : Montant total : 2500 ng, Concentration : 235 ng/μL, RIN≥7.0, 285/185≥1.0, Ligne de base & 5S : Ligne de base lisse, Pic 5S normal, Pureté : Pas d'ADN, contamination par protéines/sels, échantillons clairs et non visqueux. ARN de sang total/ARN tissulaire : Quantité totale ≥ 1 μg, Concentration : 270 ng/μL, RIN ≥ 7,0, 285/185 ≥ 1,0. Cellules triées : Extraction d'ADN Quantité suggérée : 21×106Extraction d'ARN Montant suggéré : 2×106. Poids sec des tissus animaux frais : Quantité suggérée pour l'extraction d'ADN ≥200 mg, Quantité suggérée pour l'extraction d'ARN : ≥30 mg. Sang total : Quantité suggérée pour l'extraction d'ADN ≥2 mL.
	Stratégie de séquençage PE150
	Analyse bioinformatique Évaluation de la qualité des données de séquençage Alignement et Annotation : Résultats statistiques des informations de base de l'échantillon, résultats statistiques des informations d'annotation des contigs de l'échantillon, résultats statistiques des informations d'annotation des séquences consensuelles de l'échantillon. Typage de clonotype Analyse de la diversité : comparaison des clonotypes entre les échantillons, analyse de regroupement des clonotypes chevauchants, analyse différentielle des clonotypes chevauchants. Analyse de caractérisation de population clonale à échantillon unique : Analyse des caractéristiques CDR3, Analyse des caractéristiques des gènes V/J, Analyse des caractéristiques appariées V-J.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage du répertoire immunitaire pour votre rédaction (personnalisation)

Référence:

1. Gravina, S et al. Le séquençage bisulfite à l'échelle du génome à cellule unique révèle une hétérogénéité étendue dans le méthylome du foie de souris. Biologie du génome, 2016 17(1):150.

Résultats de la démo

FAQ sur le séquençage du répertoire immunitaire

1. Qu'est-ce qui distingue les gènes d'encodage des chaînes TCR et BCR ? Existe-t-il une chaîne recommandée ?

Les chaînes Beta des récepteurs des cellules T (TCR) et les chaînes lourdes des récepteurs des cellules B (BCR) sont codées par des gènes variables (V), de diversité (D) et de jonction (J), tandis que les chaînes Alpha des TCR et les chaînes légères des BCR sont codées uniquement par des gènes V et J. Une revue de la littérature scientifique actuelle suggère une plus grande importance de la recherche axée sur la chaîne Beta des TCR et la chaîne lourde des BCR. Par conséquent, celles-ci peuvent être recommandées pour des études pertinentes, bien que le choix doive finalement être guidé par le projet et l'hypothèse.

2. La séquençage du répertoire d'immunoglobulines peut-il distinguer entre IgG, IgM, IgD et IgE ?

En séquençant la région constante (C), les isoformes des immunoglobulines (IgG, IgM, IgD et IgE) peuvent être clairement délimitées. Les amorces nécessaires pour cette différenciation sont disponibles. Cependant, il est impératif que les échantillons soient de l'ARN. Cela est réalisé par une méthode de PCR multiplex qui utilise des amorces de la région variable (V) à la région constante (C). La séquence distinctive mesure environ 30 paires de bases, ce qui donne des produits d'environ 200 à 300 paires de bases de longueur.

3. Pour le séquençage du répertoire immunitaire, est-il préférable d'utiliser de l'ADN génomique ou de l'ARN comme modèle ?

Dans le contexte du séquençage du répertoire immunitaire, l'ADN génomique (ADNg) et l'ARN jouent des rôles distincts et présentent chacun leurs propres avantages et inconvénients :

Lors de l'utilisation de l'ADNg comme matériau de référence, les avantages incluent une représentation précise du nombre de clones des récepteurs des cellules immunitaires, en raison du fait que chaque gène n'a que deux copies. Sans oublier que l'ADN est une molécule stable qui facilite le processus de stockage. Cependant, un inconvénient potentiel de l'utilisation de l'ADNg réside dans son faible nombre de copies, ce qui peut nécessiter une quantité élevée de matériel d'échantillon. De plus, la grande région d'intron entre les régions J et C pourrait entraver l'amplification de la CDR de pleine longueur en raison des limitations de longueur de séquençage.

D'autre part, l'utilisation de l'ARN permet de concevoir des amorces dans la région C, ce qui permet l'amplification de la CDR de pleine longueur, grâce à l'absence d'intron entre les régions J et C. En raison de ses niveaux d'expression élevés, la quantité de modèle provenant de l'ARN est généralement élevée, ce qui signifie qu'il pourrait être nécessaire d'utiliser moins de matériel d'échantillon. Cependant, il convient de noter que la clonalité des récepteurs des cellules immunitaires peut être influencée par les niveaux d'expression de l'ARNm, ce qui pourrait empêcher une réflexion objective du nombre réel de clones. De plus, l'ARN est moins stable que l'ADN, ce qui nécessite des procédures strictes pour la préservation et la manipulation des échantillons.

4. Quelles informations peuvent être obtenues à partir de l'IR-seq ?

L'application du séquençage des immunoglobulines ou des récepteurs (IR-seq) peut fournir des informations considérables sur l'hétérogénéité et la clonalité des populations de cellules T et B au sein d'un individu. L'IR-seq permet l'identification de spécificités particulières. Récepteur des cellules T (TCR) ou les séquences des récepteurs des cellules B (BCR), facilitant l'évaluation de l'expansion clonale, permettant une compréhension globale du répertoire, révélant des changements en réponse à des stimuli, qu'il s'agisse d'infections, de vaccinations ou de manifestations de maladies auto-immunes.

5. Quelles sont les principales étapes impliquées dans l'IR-seq ?

L'exécution de l'IR-seq est un processus en plusieurs phases. Il commence par la collecte de l'échantillon, généralement soit du sang périphérique, soit d'une biopsie tissulaire. L'extraction de l'ARN ou de l'ADN s'ensuit, suivie de l'amplification des gènes TCR ou BCR, réalisée par des méthodes telles que la PCR ou l'enrichissement ciblé. Cela est rapidement suivi par séquençage à haut débitLa dernière étape consiste en une analyse bioinformatique, visant à identifier et quantifier les séquences uniques de TCR ou de BCR présentes.

6. Quelles sont les principales applications de l'IR-seq ?

Le séquençage du répertoire immunitaire (IR-seq) est un outil fondamental, avec des applications variées tant en immunologie qu'en recherche clinique. Il est assidûment utilisé dans l'exploration des réponses immunitaires face à des facteurs externes tels que les pathogènes et les tumeurs, ainsi qu'à des défis internes comme les troubles auto-immuns. De plus, son efficacité s'étend à la surveillance d'événements tels que les transplantations pour déterminer les cas de rejet d'organe, et à l'évaluation de la diversité et de la sénescence du système immunitaire.

7. Quelles sont les technologies émergentes en séquençage IR ?

Dans le domaine en constante évolution du séquençage IR, plusieurs technologies progressistes s'établissent. Notamment, le séquençage IR à cellule unique en est une, qui offre la capacité de profiler des cellules immunitaires individuelles. Une autre est le séquençage IR spatialement résolu qui facilite la cartographie des répertoires immunitaires au sein de régions tissulaires spécifiques. De plus, l'avènement de l'apprentissage automatique et de l'intelligence artificielle renforce considérablement l'analyse de volumes importants de jeux de données IR-seq, aidant à extraire des informations significatives et potentiellement révolutionnaires.

Études de cas sur le séquençage du répertoire immunitaire

L'immunoséquençage identifie des signatures de l'historique d'exposition au cytomégalovirus et des effets médiés par les HLA sur le répertoire des cellules T.

Journal : Nature génétique
Facteur d'impact : 27,125
Publié : 03 avril 2017

Contexte

L'efficacité du système immunitaire adaptatif contre les infections dépend de la production par les cellules T de divers hétérodimères αβ. Récepteurs des cellules T (TCR) via recombinaison V(D)J. La spécificité des TCR découle de la diversité des séquences, en particulier dans la région CDR3. Les cellules T se prolifèrent lors de la reconnaissance de l'antigène, formant des populations de mémoire avec des réarrangements TCR identiques. Malgré la vaste diversité des TCRβ, des réponses T cellulaires publiques se produisent lorsque certaines chaînes TCRβ sont partagées entre les individus, en particulier en réponse à des antigènes communs. Des réponses T cellulaires publiques sont observées dans diverses maladies infectieuses et des conditions telles que les malignités et l'auto-immunité. Séquençage à haut débit des chaînes TCRβ permet d'identifier des associations significatives entre les séquences TCR et des phénotypes spécifiques, offrant des applications diagnostiques potentielles pour les conditions liées au système immunitaire.

Méthodes

Résultats

L'étude visait à identifier les séquences TCRβ associées au CMV en analysant des échantillons de sang périphérique de 641 sujets avec un statut sérologique CMV connu. Grâce à une analyse statistique, 164 chaînes TCRβ ont été trouvées significativement enrichies parmi les sujets CMV+. Une enquête ultérieure sur la restriction HLA a révélé que 45 de ces chaînes TCRβ étaient associées à des allèles HLA-A ou HLA-B spécifiques. La comparaison avec des séquences TCRβ réactives au CMV précédemment rapportées a montré que, bien que certaines se chevauchent, beaucoup ne présentaient pas d'incidence différentielle entre les sujets CMV+ et CMV- dans cette cohorte. Une analyse supplémentaire intégrant à la fois des métriques de présence/absence et d'abondance a identifié d'autres séquences TCRβ réactives au CMV, suggérant l'efficacité de cette approche pour identifier des séquences TCRβ pertinentes associées à l'infection par le CMV.

Fig 1. Identification des TCRβ associés au CMV.

Cette étude a contrôlé la profondeur d'échantillonnage du répertoire et a observé une association distincte entre le nombre de séquences TCRβ liées au CMV et le statut sérologique au CMV. Les chercheurs ont construit un classificateur binaire pour prédire le statut sérologique au CMV en fonction de la présence ou de l'absence de séquences TCRβ spécifiques au CMV, atteignant une précision remarquable (un AUROC de 0,99 pour toutes les données et 0,93 pour la validation croisée). Une validation supplémentaire réalisée sur une cohorte collectée indépendamment a confirmé la robustesse du classificateur, comme en témoigne un AUROC de 0,94 et une haute sensibilité et spécificité. Ces résultats illustrent donc le potentiel diagnostique remarquable de cette approche.

Fig 2. L'incidence des TCRβ associés au CMV est diagnostique du statut sérologique au CMV.

Conclusion

L'étude a examiné si des signatures d'exposition aux pathogènes pouvaient être détectées en analysant des données publiques. Récepteurs des cellules T (TCR) dans le répertoire des cellules T de 666 sujets avec un statut sérologique CMV connu. Ils ont développé un cadre statistique pour diagnostiquer avec précision le statut CMV, atteignant une grande spécificité et sensibilité tant dans les cohortes originales que de validation. De plus, ils ont identifié des molécules TCRβ associées au CMV et prédit avec précision les allèles HLA-A et HLA-B. L'approche a un potentiel large pour le diagnostic de divers états pathologiques et phénotypes immunologiques, offrant une stratégie de diagnostic hautement parallélisable basée sur le format commun de recombinaison TCR somatique.

Référence:

1. Emerson R O, DeWitt W S, Vignali M, et al. L'immunoséquençage identifie des signatures de l'historique d'exposition au cytomégalovirus et des effets médiés par l'HLA sur le répertoire des cellules T. Génétique de la nature, 2017, 49(5) : 659-665.