Aperçu de la stratégie pour le profilage TCR basé sur le séquençage de nouvelle génération

Aperçu des récepteurs T (TCR)

Le système immunitaire adaptatif humain déclenche la réponse immunitaire via les immunoglobulines générées par les cellules B et les TCR de type immunoglobuline sur les lymphocytes T. Les TCR sont responsables de la reconnaissance des molécules Ag-MHC (complexe majeur d'histocompatibilité). Les TCR se composent normalement de chaînes α et β hautement variables exprimées par la majorité des cellules T, ou de chaînes γ et δ exprimées par un sous-ensemble de cellules T (1–5 %). Les chaînes TCR se composent d'une région variable pour la reconnaissance des antigènes et d'une région constante. La région variable des chaînes α et δ est codée par des gènes variables (V) et de jonction (J), tandis que les chaînes β et γ sont codées par des gènes de diversité (D). Chaque chaîne TCR contient trois boucles hypervariables, c'est-à-dire des régions déterminantes de la complémentarité (CDR1–3). La spécificité antigénique des TCR est principalement déterminée par le CDR3 hypervariable de la chaîne beta, qui est formé par recombinaison de segments de gènes V, D et J avec l'ajout de nucléotides aléatoires aux jonctions des segments de gènes. La somme de tous les TCR d'un corps humain est appelée le répertoire TCR ou le profil TCR, qui peut changer considérablement avec l'apparition et la progression des maladies. Il est donc plus important de déterminer l'état du répertoire immunitaire dans différentes conditions pathologiques.

Figure 1. Interaction entre une cellule présentatrice d'antigène (APC) et une cellule T (a), et recombinaison V(D)J (b) (Rosati et al., 2017).

Séquençage TCR

Le séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné le profilage du répertoire TCR grâce à la capacité d'analyser massivement les répertoires de TCR et d'anticorps à partir d'échantillons sanguins. Nous nous concentrons principalement sur le séquençage TCR basé sur les populations cellulaires dans cette revue.

• Chaînes ou régions CDR

Les cellules T γδ sont moins intéressantes car elles se trouvent fréquemment dans les sites muqueux. La chaîne β est la principale cible d'intérêt en raison de son unicité dans les cellules uniques et de son potentiel combinatoire plus élevé par rapport aux chaînes α. Les méthodes basées sur la PCR peuvent amplifier à la fois les chaînes α et β simultanément, mais elles sont souvent séparées lors du séquençage afin d'augmenter la précision et la spécificité du résultat.

La région CDR3 a été une cible privilégiée dans de nombreuses études de profilage TCR. Bien que CDR1 et CDR2 n'interagissent pas directement avec les anticorps, elles jouent un rôle vital en contactant les molécules MHC et affectent ainsi la sensibilité et l'affinité de la liaison TCR.

• Préparation de la bibliothèque

Il existe trois méthodes courantes pour la construction de bibliothèques de profilage TCR : PCR multiplexe, enrichissement ciblé et synthèse d'ADNc 5'RACE et PCR imbriquée (Figure 2). Des codes-barres moléculaires ont été introduits lors de la synthèse d'ADNc pour minimiser l'impact des erreurs de PCR et de séquençage.

Parmi elles, les approches de PCR multiplexe sont les plus courantes et peuvent être utilisées pour l'ADNg et l'ARN. En général, des amorces pour les allèles J ou la région constante des chaînes α et β, ainsi que des amorces pour tous les allèles V connus sont utilisées pour amplifier le transcrit TCR à travers la région CDR3. Cependant, cette méthode ne peut pas détecter de nouvelles variantes d'allèles V et peut introduire des biais d'amplification.

Les kits basés sur l'enrichissement ciblé proposés par Agilent (SureSelectXT) et Illumina (TruSeq) permettent de capturer les TCR des cellules T αβ. L'ARN ou l'ADNg sont prétraités puis incubés avec des appâts ARN conçus sur mesure pour hybridiser avec la cible d'ADNg/ADNc, suivis d'une étape d'amplification supplémentaire. Les méthodes d'enrichissement ciblé sont moins sensibles aux biais de PCR.

Pour les échantillons d'ARN, l'amplification rapide des extrémités d'ADNc complémentaires 5' (5'RACE) basée sur le changement de modèle devient une norme pour les études TCR en vrac. Commercialisée par Clonotech sous le nom de technologie "SMART", cette méthode permet d'enrichir toutes les variantes de TCR dans l'échantillon. Clonotech a développé un kit commercial pour les études TCR. La synthèse d'ADNc est réalisée à l'aide d'amorces contre la région constante du transcrit d'ARNm TCR. Par la suite, une PCR imbriquée est réalisée pour amplifier la région constante.

Figure 2. Flux de travail des trois principales méthodologies pour la préparation de bibliothèques TCR (Rosati et al., 2017).

• Séquençage

Le séquençage profond permet d'acquérir un répertoire TCR plus complet. Cependant, pour les études orientées vers les maladies qui recherchent des TCR hautement exprimés, un séquençage superficiel à faible couverture peut être suffisant. Dans ce cas, l'Illumina MiSeq est couramment utilisé, tandis que l'Illumina HiSeq est plus couramment utilisé pour le séquençage profond.

Profilage TCR à partir des données RNA-Seq

Alors que le séquençage du transcriptome devient couramment utilisé dans les études fondamentales et cliniques, il pourrait servir de source importante pour le profilage TCR. Plusieurs groupes ont développé des outils pour l'extraction du répertoire TCR à partir de données RNA-seq en vrac ou unicellulaires, tels que MiXCR. Cet outil vise à extraire autant de séquences CDR3 que possible, difficilement sans faux positifs.

Références :

1. Bolotin D A, Mamedov I Z, Britanova O V, et al. Séquençage de nouvelle génération pour le profilage du répertoire TCR : caractéristiques spécifiques à la plateforme et algorithmes de correction. European journal of immunology, 2012, 42(11) : 3073-3083.
2. Bolotin D A, Poslavsky S, Davydov A N, et al. Profilage du répertoire des récepteurs d'antigène à partir de données RNA-seq. Nature biotechnology, 2017, 35(10) : 908.
3. Hsu M S, Sedighim S, Wang T, et al. Le séquençage TCR peut identifier et suivre les cellules T infiltrant les gliomes après vaccination DC. Cancer immunology research, 2016, 4(5) : 412-418.
4. Rosati E, Dowds C M, Liaskou E, et al. Aperçu des méthodologies pour l'analyse du répertoire des récepteurs T. BMC biotechnology, 2017, 17(1) : 61.
5. Luo W, Cui J H, Lin K R, et al. Le répertoire TCR comme nouvel indicateur pour le suivi immunitaire et l'évaluation du pronostic des patients atteints de cancer du col de l'utérus. Frontiers in immunology, 2018, 9 : 2729.