Aperçu du séquençage ciblé

Qu'est-ce que le séquençage ciblé ?

Séquençage ciblé (tNGS) implique l'enrichissement précis de régions ou de loci spécifiques au sein du génome, suivi du séquençage à l'aide de méthodes de nouvelle génération telles que le séquençage de nouvelle génération. Cela inclut des techniques comme le séquençage de l'exome complet, qui se concentre sur les régions codant des protéines du génome, ainsi que des panneaux de séquençage personnalisés adaptés à l'étude de gènes particuliers d'intérêt.

Lectures recommandées : WGS vs. WES vs. Panneaux de Séquençage Ciblé.

Histoire du séquençage ciblé

L'inception du séquençage des gènes dans la recherche en sciences de la vie remonte à des moments clés de l'histoire scientifique :

En 1977, Walter Gilbert et Frederick Sanger ont été les pionniers du premier séquenceur, utilisant le séquençage par terminaison de chaîne pour décoder la séquence génomique du phage X174, s'étendant sur 5 375 bases. Cette avancée a marqué le début officiel du séquençage des gènes dans l'exploration scientifique.

En s'appuyant sur cette base, en 1988, Chambehian et al. ont introduit la technologie de la PCR multiplex, posant les bases des avancées ultérieures dans les méthodologies de séquençage des amplicons PCR multiplex.

Un jalon significatif dans l'évolution de séquençage ciblé s'est produit en 2005, lorsque Nature Methods a publié un article intitulé "Sélection génomique directe." Cette approche a utilisé de l'ADN BAC marqué par de la biotine de 150 kb pour l'hybridation avec l'ADN génomique humain, suivie de la capture de fragments d'ADN à l'aide de billes d'affinité streptavidine. L'amplification PCR subséquente a facilité le séquençage, révélant qu'environ 50 % des fragments séquencés provenaient de la région cible.

Aujourd'hui, le séquençage ciblé utilise principalement deux méthodologies : la capture ciblée et la PCR multiplex, également connue sous le nom de séquençage par amplicon.

Séquençage ciblé vs. séquençage du génome entier

Séquençage du génome entier (WGS) implique le séquençage de toutes les bases de l'ensemble du génome, fournissant un profil complet de la séquence du génome. Ses principales applications incluent l'assemblage du génome et l'identification de diverses variantes génomiques, y compris les variantes structurelles.

Séquençage ciblé (également connu sous le nom de séquençage de panneaux de gènes) séquence de manière sélective des gènes spécifiques, généralement allant de quelques dizaines à mille gènes. Par conséquent, en termes de couverture génomique, le séquençage du génome entier > le séquençage de l'exome entier > le séquençage ciblé.

Le séquençage de l'exome entier peut être considéré comme un sous-ensemble du séquençage ciblé, se concentrant uniquement sur le séquençage de tous les exons dans le génome.

Le séquençage génomique complet (WGS) offre la portée de détection la plus étendue, englobant les régions codantes et non codantes, ainsi que les régions régulatrices et les variants structurels. Cependant, par rapport au séquençage ciblé, le WGS présente certaines limitations.

• Les complexités d'analyse et d'interprétation découlent de la détection de nombreux introns et variantes intragènes.
• Engendre des coûts de détection plus élevés par rapport au WES, en particulier lors de l'assurance de la profondeur et de la qualité des données.
• Nécessite des méthodologies complexes pour le stockage, l'analyse et l'annotation des données en raison de l'augmentation du volume de données.
• Le manque de références pour les variants rares dans de grands échantillons peut entraver l'analyse de pathogénicité.

En comparaison, le séquençage ciblé permet un séquençage approfondi en raison de sa région de détection plus petite (par exemple, les exons ne représentent que 1 % de toutes les séquences génétiques humaines). Cela permet la détection de variants rares et à faible fréquence tout en réduisant les coûts et les besoins de stockage. Par conséquent, le séquençage ciblé offre une solution plus rentable, en particulier pour les projets de recherche avec un financement limité et les études axées sur les maladies liées aux variants protéiques codants.

Méthodes de séquençage de l'ADN. (Bewicke-Copley et al., 2019)

Séquençage ciblé par capture d'hybridation

La capture par hybridation se présente comme une séquençage ciblé marvel, fusionnant de manière transparente l'hybridation moléculaire avec des techniques de séquençage de nouvelle génération. Cette méthode sophistiquée repose sur la conception et la synthèse minutieuses de sondes adaptées à la région génomique cible. Ces sondes, agissant comme des aimants moléculaires, se lient sélectivement aux fragments souhaités au sein de la région cible, tandis que les segments extrinsèques sont rapidement éliminés.

• Hybridation en phase solide : Cette variante implique l'attachement de la sonde à une puce en phase solide, facilitant la capture de la région cible grâce à des interactions précises entre la sonde et la cible.
• Hybridation en phase liquide : Dans cette itération, le processus expérimental se déroule dans un milieu liquide. Les sondes sont dotées de groupes biotine, permettant leur récupération après hybridation à l'aide de billes magnétiques recouvertes de streptavidine. Une fois l'hybridation terminée, ces billes piègent sélectivement les fragments cibles liés aux sondes. L'élution qui suit débarrasse la solution des fragments non liés, suivie d'une dénaturation pour libérer les fragments cibles capturés. Grâce à une capture magnétique stratégique, les sondes résiduelles non liées sont ensuite éliminées, garantissant la pureté et l'intégralité des séquences capturées.

La capture par hybridation orchestre ainsi une symphonie d'interactions moléculaires, culminant dans l'isolement précis et le séquençage des régions génomiques cibles.

Séquençage ciblé par PCR multiplexe

PCR multiplexe séquençage cibléégalement appelé séquençage d'amplicons ciblés, intègre de manière transparente la technologie de PCR multiplex avec les méthodes de séquençage de nouvelle génération. Cette approche innovante permet l'amplification simultanée de plusieurs séquences de régions cibles, produisant des produits d'amplicon. Par la suite, des séquences d'adaptateurs nécessaires au séquençage de nouvelle génération sont introduites aux deux extrémités des produits d'amplicon, réalisées soit par amplification PCR, soit par des réactions de ligature enzymatique. Cette étape transforme les amplicons en bibliothèques prêtes pour le séquençage de nouvelle génération.

Après la préparation de la bibliothèque, le séquençage de nouvelle génération est réalisé, suivi d'une analyse des données brutes. Ce processus complet fournit des informations de séquence spécifiques aux régions cibles, répondant à l'objectif principal du séquençage ciblé.

• Applications courantes

Le séquençage ciblé par PCR multiplex trouve une large application dans divers domaines. Par exemple, dans le domaine de la détection des agents pathogènes, cette technique facilite l'analyse de la composition et de la distribution des microorganismes pathogènes. De telles analyses jouent un rôle crucial dans le diagnostic des infections pathogènes cliniques, contribuant de manière significative à la gestion des maladies et aux stratégies de traitement.

Le séquençage ciblé par PCR multiplex émerge ainsi comme un outil polyvalent, facilitant la détection précise et la caractérisation des régions génomiques cibles dans diverses applications.

Tableau 1 Différences entre le séquençage génomique complet (WGS), les panneaux NGS par capture par hybridation et les panneaux NGS par PCR multiplexe

Évaluation des données pour le séquençage ciblé

La qualité des données obtenues par capture de la région du gène cible est principalement évaluée à travers les indicateurs clés suivants : la couverture de la région cible, l'efficacité de capture et l'homogénéité de la couverture de la région cible.

• Couverture de la région cibleCette métrique désigne la proportion de régions détectées par rapport à la région cible totale. Idéalement, toutes les régions d'intérêt devraient être couvertes. Cependant, en raison de considérations de conception des sondes telles que le contenu en GC, les caractéristiques de séquence, la variation du nombre de copies et la similarité des séquences, une petite fraction de la région cible peut être exclue de la capture, généralement autour de 0-3 %. En général, une couverture cible plus élevée indique une meilleure performance des sondes ou du PCR multiplex.
• Efficacité de captureCette mesure représente le pourcentage de données alignées à la région cible par rapport au total des données obtenues. Une efficacité de capture plus élevée reflète une meilleure utilisation des données de séquençage. Il est crucial d'évaluer les caractéristiques de la séquence lors de la conception des sondes. Les sondes qui se lient fréquemment à des régions de séquence en double ou à copies élevées peuvent capturer des régions non cibles, réduisant ainsi l'efficacité de capture. Concevoir des sondes plus spécifiques peut atténuer le lien avec des séquences non spécifiques, améliorant ainsi l'efficacité de capture.

L'évaluation de ces paramètres garantit la fiabilité et l'efficacité des données de séquençage ciblé, fournissant des informations précieuses sur les régions génomiques visées.

Flux de travail pour l'échantillonnage et le traitement des données de séquençage de nouvelle génération ciblé. (Gulilat et al., 2019)

Facteurs influençant l'efficacité de capture

• Régions riches en GCDes régions telles que les régions non traduites (UTR) et les promoteurs présentent souvent un contenu élevé en GC, ce qui entraîne des efficacités de capture plus faibles. Cette différence d'efficacité de capture entre les régions riches en GC et les autres peut entraîner une couverture inégale.
• Qualité de l'ADNLa qualité de l'ADN en entrée impacte significativement le biais de capture, particulièrement évident dans les échantillons extraits de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) où les niveaux de fragmentation varient. L'utilisation d'instruments d'électrophorèse automatisés Agilent tels que le Bioanalyzer 2100 ou l'analyseur Tapestation pour le contrôle de qualité garantit un équilibre de capture et minimise le biais d'analyse en aval.
• Quantité d'ADN d'entréeUne quantité d'ADN insuffisante nécessite des cycles PCR supplémentaires lors de la construction de la bibliothèque, ce qui augmente les duplicatas PCR et diminue l'utilité des données. Les avancées technologiques ont réduit la quantité d'ADN requise de microgrammes à nanogrammes pour le séquençage ciblé.
• PseudogènesLa présence de pseudogènes peut perturber l'uniformité de la couverture, affectant ainsi la précision des données.
• Taille des fragments d'ADNLe couplage optimal de la taille des fragments à la conception des sondes améliore l'efficacité de capture. L'utilisation d'instruments d'électrophorèse automatisés Agilent, tels que le Bioanalyzer 2100, garantit une détection précise de la taille des fragments.
• Éléments répétésLes éléments répétés peuvent entraver l'uniformité de la distribution des lectures au sein de l'exome, nécessitant une profondeur de séquençage accrue pour la détection des SNP.
• Homogénéité de la couvertureAssurer une profondeur de couverture uniforme à travers les régions est essentiel pour des données de haute qualité. Atteindre une couverture à forte homogénéité nécessite une construction de bibliothèque préliminaire soigneuse. Des méthodes telles que la fragmentation de l'ADN sans biais, l'utilisation d'enzymes d'amplification avec une faible préférence pour le contenu en GC, la minimisation des cycles d'enrichissement PCR et l'optimisation de la conception des sondes et des conditions d'hybridation améliorent l'homogénéité de la couverture lors des expériences de capture.

Applications du séquençage ciblé

Séquençage ciblé sert de complément précieux au séquençage du génome entier, rationalisant à la fois les procédures expérimentales et les objectifs analytiques. Sa nature rapide et efficace a créé un créneau unique dans le séquençage à haut débit de nouvelle génération, avec un éventail croissant de domaines d'application.

• Essai de typage SNP : Le séquençage ciblé facilite les essais de typage des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), permettant une analyse précise des variations génétiques.
• Séquençage de l'exome entierEn se concentrant sur les régions codant pour des protéines, le séquençage de l'exome entier avec des approches ciblées offre des perspectives sur la variation génétique associée aux maladies et aux traits.
• Identification des lignées : Le séquençage ciblé aide à l'identification et à la caractérisation de lignées génétiques spécifiques, ce qui est crucial dans les études de reproduction et génétiques.
• Analyse de l'héritabilité de la population : Étudier les variations génétiques à travers les populations aide à comprendre l'héritabilité et la diversité génétique, essentielles pour la génétique des populations et les études évolutives.
• Organoïde de feuilleSéquençage du génome mitochondrialLe séquençage ciblé de génomes d'organelles spécifiques ou de régions tissulaires spécifiques fournit des informations précieuses pour comprendre le développement des organoïdes ou la génétique mitochondriale.
• Technologie de capture : Les technologies de capture ciblée permettent un séquençage précis de régions génomiques spécifiques, offrant flexibilité et efficacité dans la conception expérimentale.
• Dépistage des traits dominants : Le séquençage ciblé facilite l'identification des variants génétiques sous-jacents aux traits dominants, aidant ainsi à la cartographie des traits et aux efforts d'amélioration génétique.
• Localisation de QTL : Cartographie des loci de traits quantitatifs (QTL) utilisant séquençage ciblé aide à identifier les régions génomiques associées à des traits complexes, améliorant notre compréhension des relations génotype-phénotype.
• Développement de marqueurs moléculaires pour la sélection : Le séquençage ciblé contribue au développement de marqueurs moléculaires pour les programmes de sélection, permettant la sélection assistée par marqueurs et l'amélioration rapide des cultures.
• Séquençage de méthylationLe séquençage ciblé permet une analyse précise des motifs de méthylation de l'ADN, offrant des perspectives sur la régulation épigénétique et la dynamique de l'expression génique.
• Classification des espèces, développement phylogénétique : Le séquençage ciblé aide à la classification des espèces et aux études phylogénétiques en examinant des régions ou des marqueurs génomiques spécifiques, éclairant ainsi les relations évolutives et la biodiversité.

Références :

1. Bewicke-Copley, Findlay, et al. "Applications et analyse du séquençage génomique ciblé dans les études sur le cancer." Journal de biotechnologie computationnelle et structurale 17 (2019) : 1348-1359.
2. Gulilat, Markus, et al. "Le séquençage de nouvelle génération ciblé comme outil pour la médecine de précision." BMC génomique médicale 12 (2019) : 1-17.