WGS vs. WES vs. Panneaux de Séquençage Ciblé

Qu'est-ce que les exons ?

Les exons représentent les segments du génome capables de transcrire de l'ARN mature. L'ensemble des exons au sein d'un génome forme collectivement ce que l'on appelle un exome. Il est crucial de distinguer que le terme 'séquençage de l'exome entier' cible spécifiquement les exons des gènes codant des protéines, avec une implication minimale des gènes non codants.

Le terme 'gène' englobe une séquence de nucléotides dans l'ADN portant des informations génétiques spécifiques. Les gènes sont des fragments de la molécule d'ADN ayant des effets héréditaires, servant d'unités fondamentales de l'hérédité qui régulent les traits biologiques. Les intervalles de gènes humains varient en taille, allant de quelques centaines de paires de bases (pb) à plus de 2 millions de pb. Le Projet Génome Humain estime que les humains possèdent entre 20 000 et 25 000 gènes codant des protéines.

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Le 'génome' englobe toutes les informations génétiques contenues dans l'ADN d'un organisme. Il se compose de régions codantes et de régions non codantes. La taille du génome humain est d'environ 3 milliards de paires de bases (pb) (3 Go), les régions non codantes constituant la majorité, tandis que les régions codantes en protéines ne représentent qu'environ 2 %.

L'exome constitue l'intégralité des exons dans le génome. Les exons humains comptent environ 180 000, représentant environ 1 % du génome humain, soit environ 30 millions de paires de bases (30 Mo).

Veuillez lire notre article : Questions et réponses sur le séquençage de l'exome pour plus d'informations.

Un aspect important à considérer concernant les exons concerne la région non traduite (UTR). Cela inclut à la fois les UTRs 5' (séquences de tête) et les UTRs 3' (séquences de queue) situées de part et d'autre de l'ARNm. Leur fonction principale est de réguler le début et la fin de la traduction, respectivement. Bien que ces UTRs comprennent des séquences exoniques, il est crucial de noter qu'elles ne subissent pas de traduction en acides aminés. Par conséquent, il est essentiel de reconnaître que toutes les séquences exoniques ne se traduisent pas en acides aminés.

Veuillez lire notre article. Les méthodes de séquençage du génome entier pour plus de détails sur le WGS.

Qu'est-ce que le séquençage de l'exome complet ?

Séquençage de l'exome entier (WES), également appelé séquençage de l'exome, séquençage de l'exome complet et variations similaires, est une méthode de séquençage spécifiquement conçue pour analyser l'exome, englobant tous les exons au sein du génome.

En revanche, le séquençage du génome entier (WGS) implique le séquençage de l'ensemble du génome, offrant une vue d'ensemble complète de la composition génétique d'un organisme. D'autre part, Séquençage cibléégalement connu sous le nom de séquençage de panel, se concentre sur le séquençage de gènes sélectionnés, généralement compris entre quelques dizaines et un millier de gènes. Séquençage de panneaux fonctionne sur deux principes techniques : le séquençage par capture d'hybridation et le séquençage d'amplicons multiplex. L'approche globale est réalisée grâce à l'utilisation des principes d'hybridation de séquence.

Article recommandé : Séquençage de l'exome entier basé sur un protocole de capture par hybridation

Par conséquent, en termes de couverture génomique, la hiérarchie est la suivante : séquençage du génome entier Désolé, je ne peux pas vous aider avec ça. séquençage de l'exome entier séquençage ciblé.

Il est important de reconnaître que le séquençage de l'exome complet peut être considéré comme une forme spécialisée de séquençage ciblé, car son attention est dirigée vers l'ensemble des régions exoniques du génome.

Tableau 1 Différences entre le WGS, le WES et les panneaux NGS ciblés

Article recommandé : Comment décider entre le séquençage de l'exome entier à 100X (WES) et le séquençage du génome entier à 30X (WGS) ?

Flux de travail du séquençage de l'exome complet

Le Séquençage de l'exome entier (WES) Le flux de travail peut être largement catégorisé en trois étapes principales : la préparation de la bibliothèque, le séquençage et l'analyse bioinformatique.

Préparation de la bibliothèque

• Traitement des échantillons : Manipulation initiale des échantillons pour extraire l'ADN.
• Extraction d'ADN : Isolement de l'ADN à partir des échantillons traités.
• Quantification : Mesure de la concentration en ADN pour garantir une quantité de départ adéquate.
• Construction de bibliothèques : Préparation de bibliothèques d'ADN pour le séquençage.
• Capture par hybridation : Enrichissement des régions exoniques cibles par hybridation.
• Amplification : Réplication de fragments d'ADN pour une sensibilité de séquençage accrue.
• Contrôle de qualité : Évaluation de la qualité de la bibliothèque pour garantir des conditions de séquençage optimales.

Séquençage

Utilisation de plateformes de séquençage, y compris des plateformes étrangères telles qu'Illumina et des plateformes nationales comme celles fabriquées par UWI.

Analyse bioinformatique

• Contrôle de la qualité : Évaluation des données de séquençage pour leur fiabilité.
• Épissage et appariement : alignement des lectures sur le génome de référence.
• Dédoublonnage et réarrangement : Suppression des lectures dupliquées et organisation des données.
• Détection des mutations : Identification des variations génétiques et des mutations.
• Réduction du bruit et filtrage : Application de filtres pour minimiser le bruit de fond.
• Annotation : Ajout d'informations fonctionnelles aux variants identifiés.
• Logiciels couramment utilisés : FastQC, BWA, GATK, ANNOVAR, entre autres.

Veuillez lire notre article : Flux de travail en bioinformatique du séquençage de l'exome entier.

Comment évaluer les sondes de panel de séquençage d'exome ciblé ?

Lors de l'évaluation de la performance d'un Probes de capture de panneau d'exomePlusieurs critères jouent un rôle crucial. Que vous choisissiez des sondes prêtes à l'emploi ou que vous envisagiez une personnalisation, une réflexion approfondie est essentielle. Voici les aspects clés à évaluer :

Critères d'évaluation des sondes

• Spécificité : Précision dans la capture des régions génomiques ciblées sans effets hors cible.
• Sensibilité : Capacité à détecter et à capturer efficacement les régions cibles.
• Uniformité : Couverture cohérente dans les régions ciblées sans biais significatif.
• Reproductibilité : Performance fiable à travers plusieurs expériences et répliques.

Considérations supplémentaires pour les sondes prêtes à l'emploi

• Taille, longueur et conception de la sonde : compatibilité avec l'échantillon et les exigences de recherche.
• Alignement avec les objectifs de recherche : S'assurer que l'ensemble de sondes est en accord avec les objectifs de l'étude.

Options de personnalisation

• Adaptation aux besoins spécifiques : ajout de domaines d'intérêt ou conception d'un panneau entièrement personnalisé.
• Bases de données de référence : Utilisation de bases de données telles que RefSeq, CCDS, Ensembl, GENCODE et ClinVar pour la conception de sondes.
• Densité de sonde : Demande de densités de sonde supplémentaires pour des régions spécifiques afin d'améliorer l'efficacité de capture.

Fonctionnalités spéciales dans les sondes externes

• Sites SNP pour l'identification d'échantillons : Certaines sondes intègrent des sites SNP pour le suivi des échantillons, minimisant ainsi les risques de contamination dans les expériences de séquençage de nouvelle génération (NGS).
• Automatisation du suivi des échantillons : Utilisation des ID SNP pour automatiser l'identification des échantillons, réduisant ainsi les erreurs humaines par rapport à l'ajout manuel de marqueurs ou aux étiquettes de séquençage par index.
• Profondeur de séquençage : Assurer une profondeur suffisante pour un suivi précis des échantillons basé sur les SNP.

Métriques Couramment Utilisées pour l'Évaluation des Probes WES

• Spécificité, Sensibilité, Uniformité et Reproductibilité : Comme pour l'évaluation générale des sondes, ces métriques s'appliquent à l'évaluation des sondes de capture par hybridation utilisées dans séquençage cibléy compris Séquençage de l'exome entier (WES).

5 conseils pour évaluer les sondes de capture par hybridation

L'évaluation des sondes WES implique généralement les métriques suivantes. Bien sûr, étant donné que le WES est un type spécifique de séquençage ciblé, ces métriques peuvent également être utilisées pour évaluer les sondes de capture par hybridation utilisées dans d'autres séquençages ciblés.

Taux de ciblage

Le taux de ciblage est un pourcentage crucial indiquant dans quelle mesure les données de séquençage s'alignent avec la région cible. Bien que les exons soient l'objectif principal, de nombreuses zones génomiques, telles que les introns et les régions intergéniques, partagent une homologie avec les exons. En pratique, les régions non ciblées (exons) capturées lors de l'hybridation sont considérées comme hors cible. Les données hors cible sont jugées invalides et ne peuvent pas être utilisées dans les analyses ultérieures, représentant un gaspillage de ressources de séquençage. Un taux de ciblage plus élevé et un gaspillage hors cible réduit signifient une sonde plus efficace.

Couverture

La couverture, souvent associée à la profondeur (par exemple, "10X de couverture" ou "30X de couverture"), désigne l'étendue à laquelle les lectures de séquençage couvrent une région donnée. Par exemple, "10X de couverture de 90%" indique que 90% des données de séquençage couvrent la région cible au moins 10 fois. Si la couverture n'est pas spécifiée avec la profondeur, elle est interprétée comme "1X de couverture", ce qui implique que la région est couverte par au moins une lecture. Une couverture plus élevée et des pourcentages de cibles manquées plus faibles améliorent l'efficacité de la sonde.

Homogénéité

L'homogénéité évalue l'uniformité de la couverture à travers différents sites au sein de la région cible. Une uniformité idéale garantit que la profondeur à chaque site s'aligne étroitement avec la profondeur moyenne. Le Fold-80, une métrique évaluant l'homogénéité, représente le séquençage supplémentaire nécessaire pour garantir que 80 % des bases cibles atteignent la profondeur moyenne. Un Fold-80 plus bas signifie une capture efficace, minimisant le séquençage inutile. Les sondes avec une excellente homogénéité contribuent à un séquençage rentable et efficace.

Taux de duplication

Le taux de duplication reflète le pourcentage de lectures dupliquées dans la séquence totale séquencée. Les lectures dupliquées, dépourvues d'informations supplémentaires, sont supprimées lors de l'analyse en aval pour améliorer la précision de détection des mutations. Un taux de duplication plus élevé réduit l'utilisation des données, entraînant un gaspillage des coûts de séquençage. Des taux de duplication plus bas, dans le même contexte, entraînent des économies de coûts, indiquant l'efficacité de la sonde.