Aperçu de la technologie de séquençage par nanopore

Résumé

Les gènes codent l'intégralité des informations héréditaires d'un organisme, et le séquençage est le processus de conversion des signaux chimiques de l'ADN en signaux numériques exploitables, rendant le séquençage indispensable dans la recherche génomique. L'avènement de Séquençage de Sanger le séquençage de première génération a propulsé la réalisation du Projet Génome Humain, marquant des avancées significatives dans la technologie de séquençage génomique au cours des dernières décennies. L'avancement continu de séquençage de nouvelle génération les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont conduit à une réduction progressive du coût du séquençage génomique, accompagnée d'une augmentation du débit de séquençage et de la précision, facilitant ainsi l'analyse de la structure du génome et l'étude de la variation génétique génomique, faisant ainsi avancer considérablement la recherche génomique. Cependant, dans le séquençage NGS, les erreurs introduites par l'amplification PCR lors de la construction de la bibliothèque et les longueurs de lecture de séquençage généralement courtes (souvent inférieures à 500 pb) empêchent souvent la technologie de répondre aux exigences plus élevées de certaines enquêtes biologiques modernes. Par exemple, des défis se posent pour déterminer des segments répétitifs plus longs sur l'ADN et pour évaluer les modifications de méthylation de l'ADN/ARN. Par conséquent, l'émergence des technologies de séquençage de troisième génération, telles que le séquençage par nanopores, répond à ces limitations. Le séquençage par nanopores permet de déterminer des longueurs de lecture plus longues (jusqu'à 10 kpb) sans avoir besoin de processus complexes de construction de bibliothèque. Au cours des dernières années, Séquençage par nanopore a suscité une attention considérable de la part de la communauté scientifique.

Aperçu du séquençage par nanopore

1. Qu'est-ce que le séquençage par nanopore ?

Le séquençage implique principalement l'identification des quatre bases nucléotidiques de l'ADN. En raison des similitudes chimiques frappantes entre les bases purines et pyrimidines, les distinguer pose des défis significatifs. Actuellement, la présence des quatre bases est principalement convertie en signaux tels que des signaux lumineux, électriques ou de pH, et les différences dans l'amplification des signaux sont utilisées pour identifier les différentes bases. Séquençage par nanoporeCependant, il convertit directement les quatre bases en signaux électriques, permettant leur identification par des variations dans les signaux de courant et les motifs d'onde. De plus, le séquençage par nanopore diffère des techniques traditionnelles de première génération et de séquençage de nouvelle génération (NGS), qui impliquent une synthèse et un séquençage simultanés. Le séquençage par nanopore séquence directement des molécules individuelles, éliminant ainsi le besoin d'amplification PCR lors du séquençage, ce qui permet de réduire efficacement les erreurs systématiques résultant des biais de PCR. Originaire des années 1980, le séquençage par nanopore a continuellement progressé avec le développement de protéines nanopore et de protéines moteurs, culminant finalement dans sa réalisation.

Jalons dans le séquençage de l'ADN par nanopore (David et al., 2016)

2. Comment fonctionne le séquençage par nanopore ?

Le principe de fonctionnement du séquençage par nanopore

Dans séquençage par nanoporeLes protéines nanopores sont immobilisées sur une membrane polymère et immergées dans une solution électrolytique, seuls les nanopores de la membrane permettant aux ions de passer. En appliquant une différence de potentiel stable à travers les nanopores à l'aide d'une source d'alimentation externe, les ions électrolytiques traversent les nanopores, générant un courant électrique à travers la membrane. Guidées par des protéines motrices, les molécules d'ADN double brin (ADNdb) (ou les duplex hybrides ARN-ADN) sont d'abord déroulées, permettant à l'ADN ou à l'ARN simple brin de transloquer à travers le nanopore du côté négatif (cis) vers le côté positif (trans). En raison des volumes et des propriétés de charge différents des nucléotides, leur passage à travers le nanopore induit des changements distincts dans le courant électrique à travers la membrane, permettant l'identification et le séquençage des séquences d'ADN.

La première protéine de nanopore découverte pour influencer les courants ioniques et permettre leur détection via l'ADN ou l'ARN était l'α-Hémolysine, une protéine membranaire dérivée de S. aureus. Une autre protéine de nanopore couramment utilisée est la MspA, avec des diamètres de pore proches de 1-2 nm. Cependant, en l'absence de protéines de nanopore, la translocation de l'ADN se produit trop rapidement pour obtenir des signaux de courant électrique significatifs, nécessitant l'introduction de protéines moteurs pour contrôler le taux de translocation de l'ADN. En 2012, des chercheurs ont découvert que la polymérase de l'ADN phi29, lorsqu'elle est utilisée comme protéine moteur en conjonction avec les protéines de nanopore mentionnées, régule efficacement la translocation de l'ADN, produisant des signaux clairs et de haute résolution.

Principe du séquençage par nanopore (Wang et al., 2021)

Le flux de travail du séquençage par nanopore

Extraction d'ADNExtraction d'ADN ou d'ARN à partir d'organismes ou de tissus, suivie de la purification.

Construction de bibliothèqueLa réparation des extrémités et la ligature des adaptateurs sont effectuées sur l'ADN ou l'ARN. Ces séquences d'adaptateurs contiennent des séquences spécifiques qui interagissent avec la protéine de nanopore sur le dispositif de séquençage par nanopore, permettant aux molécules d'être guidées avec précision à travers le nanopore. Par la suite, un contrôle de qualité et une sélection de taille des fragments sont réalisés pour s'assurer que la taille et la distribution de qualité des molécules dans la bibliothèque répondent aux exigences.

Chargement et séquençageLa bibliothèque construite est chargée dans le dispositif de séquençage par nanopore pour le séquençage. À l'intérieur du dispositif, les molécules sont guidées à travers le nanopore, et les séquences d'ADN ou d'ARN sont séquencées en surveillant les variations du courant électrique.

Flux de préparation de bibliothèque pour les technologies Oxford Nanopore (ONT) (Wang et al., 2021)

3. Applications puissantes de séquençage par nanopores

L'application dans le séquençage du génome

L'utilisation de technologie de séquençage par nanopore Le séquençage du génome est vaste. Il peut être utilisé pour améliorer les génomes de référence existants, le génome de référence humain étant un exemple majeur. Actuellement, le séquençage par nanopores a comblé 12 lacunes (>50 kb chacune) dans le génome de référence humain, y compris des séquences de répétitions télomériques et des centromères du chromosome Y. En dehors du génome humain, les génomes de référence d'autres espèces peuvent également être élargis et affinés grâce au séquençage par nanopores. En identifiant avec précision les régions répétitives, par exemple, le génome de référence de Caenorhabditis elegans a été étendu de plus de 2 Mb. Le séquençage par nanopores a également été utilisé pour lire des génomes non référencés précédemment non rapportés, comme l'assemblage du premier génome de Rhizoctonia solani à l'aide de données de séquençage par nanopores. Pour les virus à ARN, ONT peut également les séquencer, comme le virus Zika, le virus de la grippe, entre autres. Pendant la pandémie de COVID-19, ONT a aidé à déterminer rapidement le génome viral complet du SARS-CoV-2 grâce au séquençage cDNA et au séquençage direct de l'ARN, apportant des contributions significatives aux efforts de développement de vaccins ultérieurs.

L'application en épigénétique

Le rôle de séquençage par nanopore La recherche en épigénétique est de plus en plus en avant. Des études indépendantes dès 2013 ont démontré la capacité de distinguer les cytosines méthylées (5mC et 5hmC) dans l'ADN en utilisant des signaux de courant caractéristiques dans le séquençage par nanopore MspA. Par la suite, le développement d'outils bioinformatiques a permis l'identification de trois modifications de l'ADN (6mA, 5mC et 5hmC) à partir des données ONT. Des méthodes comme MeSMLR-seq et SMAC-seq, combinant le séquençage ONT avec un traitement par méthyltransférase exogène, ont été conçues pour cartographier l'occupation des nucléosomes et l'accessibilité de la chromatine. De plus, le séquençage ONT permet la caractérisation simultanée de diverses caractéristiques épigénétiques sur de longues molécules d'ADN humain, y compris le méthylome 5mC endogène et l'occupation des nucléosomes. Des approches expérimentales comme DiMeLo-seq et BIND&MODIFY intègrent également le séquençage ONT avec diverses techniques biochimiques pour cartographier les modifications des histones, les variantes d'histones et les interactions spécifiques protéine-ADN.

L'application dans le cancer

Séquençage par nanopore est essentiel à la recherche sur le cancer, couvrant divers types de cancer tels que la leucémie, le cancer du sein, les tumeurs cérébrales, le cancer colorectal, le cancer du pancréas et le cancer du poumon. Son rôle principal réside dans l'identification des variations génomiques critiques, en particulier celles qui sont complexes et étendues. Par exemple, chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique, le séquençage d'amplicons par nanopore détecte efficacement les mutations TP53. De plus, en combinant l'enrichissement ciblé assisté par Cas9 avec le séquençage par nanopore, des analyses détaillées du gène de susceptibilité au cancer du sein BRCA1 et de ses régions adjacentes, couvrant une étendue de 200 kb, fournissent des informations sur l'ensemble des altérations génétiques dans les gènes de la maladie concernés. Le séquençage par nanopore identifie également directement les modifications de l'ADN, capturant les changements génomiques et épigénomiques dans des échantillons de tumeurs cérébrales, offrant ainsi un outil de diagnostic moléculaire polyvalent et rapide pour le cancer. De plus, le séquençage cDNA MinION permet la détection le jour même des gènes de fusion dans des échantillons cliniques. L'efficacité de cette technologie rationalise l'ensemble du processus, de la collecte d'échantillons à l'analyse bioinformatique en passant par les stratégies de traitement personnalisées, le tout réalisable en une seule journée. Au-delà du cancer, le séquençage par nanopore présente un potentiel considérable pour l'étude des maladies infectieuses et héréditaires.

4. Quels sont les avantages du séquençage par nanopores ?

Séquençage par nanopore présente plusieurs avantages :

• Les échantillons de séquençage sont extrêmement faciles à préparer.
• La longueur de lecture est exceptionnellement longue, atteignant plusieurs millions de paires de bases, dépassant la séquençage de deuxième génération par 1 000 fois, et surpassant également le séquençage Pac Bio de troisième génération (dizaines de milliers de paires de bases).
• Il peut séquencer directement des molécules d'ARN et détecter des modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l'ADN.
• Le coût est faible, environ 150 $ par expérience (exécution).
• La vitesse de séquençage est rapide, avec une préparation d'échantillon prenant environ 10 minutes et le séquençage environ 40 minutes.

FAQ

Quelle est la différence entre Illumina et Nanopore ?

Illumina et Nanopore sont deux méthodologies de séquençage largement reconnues, chacune caractérisée par des principes et des approches opérationnelles uniques.

Le séquençage Illumina, classé comme séquençage de deuxième génération, suit le principe de la synthèse et du séquençage simultanés. Cette méthode consiste à fragmenter l'ADN en séquences plus courtes, suivie d'un séquençage parallèle à haut débit. Malgré son exactitude et son rapport coût-efficacité louables, le séquençage Illumina produit généralement des longueurs de lecture relativement courtes, allant typiquement de quelques centaines à quelques milliers de paires de bases.

En revanche, Séquençage par nanopore présente une approche distinctive, séquençant directement des molécules d'ADN ou d'ARN à travers des nanopores, éliminant ainsi le besoin d'amplification par PCR. Lors du séquençage par nanopore, à mesure que l'ADN passe à travers de minuscules nanopores, les variations de courant électrique induites par les nucléotides sont capturées et traitées pour générer des séquences d'ADN. Cette technique offre l'avantage notable de longueurs de lecture ultra-longues, s'étendant jusqu'à des millions de paires de bases. De plus, le séquençage par nanopore simplifie le processus et facilite l'analyse rapide des données en temps réel. Cependant, il est important de noter que le séquençage par nanopore peut présenter une précision légèrement réduite par rapport au séquençage Illumina.

2. Qu'est-ce que le séquençage par nanopore d'Oxford ?

Le séquençage par nanopore d'Oxford (ONS) se présente comme une technologie de séquençage de l'ADN et de l'ARN à la pointe de la technologie, développée par ONT. Au cœur de cette technique se trouve l'utilisation d'un pore protéique à l'échelle nanométrique intégré dans une membrane polymère hautement résistante. Pendant le processus de séquençage, une tension constante est appliquée à travers la membrane, permettant aux molécules d'ADN ou d'ARN simple brin chargées négativement de traverser le nanopore. À mesure que ces molécules d'acides nucléiques passent à travers le nanopore, elles induisent des fluctuations dans le courant ionique, qui correspondent à la séquence de nucléotides traversant le nanopore et peuvent être décodées en temps réel à l'aide d'algorithmes informatiques, permettant un séquençage instantané de l'ADN ou de l'ARN. La technologie de séquençage par nanopore présente plusieurs caractéristiques notables, notamment une longue longueur de lecture, un séquençage en temps réel, un séquençage direct de l'ARN et une portabilité. L'application d'ONT s'étend à divers domaines, y compris la génomique, la transcriptomique, l'épigénétique et la recherche sur les maladies infectieuses. À mesure que la technologie continue d'évoluer, son champ d'application et son impact devraient encore s'élargir.

3. La séquençage par nanopore est-il le plus précis ?

Séquençage par nanopore La technologie représente une approche innovante du séquençage de l'ADN, offrant des avantages distincts que les méthodes traditionnelles manquent souvent. Ses caractéristiques notables incluent des longueurs de lecture exceptionnellement longues et la capacité d'effectuer une analyse de données en temps réel, la distinguant des techniques de séquençage conventionnelles. Cependant, bien que le séquençage par nanopores excelle dans ces domaines, sa précision peut ne pas toujours égaler celle des méthodes alternatives. En ce qui concerne l'exactitude, le séquençage par nanopores présente fréquemment des taux d'erreur plus élevés par rapport aux plateformes établies comme le séquençage Illumina. Les plateformes Illumina produisent généralement des données de courtes lectures avec des taux d'erreur allant de 0,1 % à 1 %, tandis que le séquençage par nanopores peut donner des taux d'erreur compris entre 6 % et 15 %. Par conséquent, les applications exigeant une précision maximale, telles que la détection de polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) ou l'analyse de variantes à petite échelle, peuvent trouver le séquençage par nanopores sous-optimal.

Pour atténuer les problèmes de précision, les chercheurs utilisent diverses stratégies, notamment plusieurs itérations de séquençage de la même molécule d'ADN pour générer des séquences consensuelles, l'utilisation d'approches hybrides de correction d'erreurs qui intègrent des données de lectures longues et courtes, et l'avancement des algorithmes d'appel de bases. Malgré ces efforts, la précision du séquençage par nanopore reste limitée par sa nature de séquençage de molécules uniques, caractérisée par un rapport signal-bruit relativement faible au niveau de la molécule individuelle.

En résumé, le séquençage par nanopores présente des avantages inégalés dans des applications spécifiques, notamment celles nécessitant de longues longueurs de lecture et des analyses en temps réel. Néanmoins, sa précision peut ne pas dépasser celle de certaines technologies de séquençage établies. Par conséquent, le choix de la méthodologie de séquençage dépend des exigences et des objectifs précis de l'entreprise de recherche.

Références :

1. Deamer D, Akeson M, Branton D. Trois décennies de séquençage par nanopore. Nat Biotechnol2016 ; 34(5) : 518-524. doi : 10.1038/nbt.3423
2. Wang Y, Zhao Y, Bollas A, Wang Y, Au KF. Technologie de séquençage par nanopores, bioinformatique et applications. Nat Biotechnol. 2021;39(11):1348-1365. doi:10.1038/s41587-021-01108-x