Principe du séquençage par nanopore

Introduction au séquençage par nanopores

L'essence de Séquençage de l'ADN réside dans l'identification des quatre nucléotides : adénine (A), thymine (T), cytosine (C) et guanine (G). Cependant, le processus de reconnaissance est difficile pour deux raisons principales. Premièrement, ces bases sont incroyablement petites, existant à l'échelle du nanomètre. Deuxièmement, les structures chimiques des paires de bases purines et des paires de bases pyrimidines sont remarquablement similaires, compliquant leur différenciation. Depuis la proposition de la structure en double hélice de l'ADN en 1953, les biologistes cherchent sans relâche diverses méthodologies pour l'identification de ces quatre bases.

Les méthodologies de séquençage prédominantes actuelles incluent la transduction de la présence des quatre bases en signaux tels que la lumière, les variations du pH de la solution ou des signaux électriques. Les bases distinctes sont discernées en fonction des différences dans leurs signaux amplifiés. Ces stratégies constituent la pierre angulaire des équipements de séquençage grand public actuels. Notamment, des plateformes telles que Sanger, Illumina, BGIseq et Pacbio ont opté pour des signaux lumineux. En revanche, Ion Torrent utilise des variations du pH de la solution, tandis que Nanopore privilégie les signaux électriques. Le processus de séquençage repose non seulement sur des technologies de pointe, mais souligne également l'aspect innovant qui s'apparente à une forme d'art.

Le paradigme de Séquençage par nanopore la technologie trouve ses débuts dans les années 1990, et son évolution repose sur trois sauts technologiques majeurs. Dans un premier temps, la transmission de molécules d'ADN uniques à travers un nanopore a été réalisée ; un exploit suivi par l'adoption d'un processus enzymatique sur le nanopore pour la supervision du séquençage à une résolution d'un seul nucléotide. En fin de compte, la précision du séquençage à un seul nucléotide est devenue une réalité. Ces avancées innovantes ont collectivement renforcé le progrès de Séquençage par nanopore technologie.

Principe du séquençage par nanopore

Séquençage par nanopores fonctionne sur le principe d'immerger une membrane polymère synthétisée artificiellement dans une solution ionique. Cette membrane polymère est ponctuée de structures de protéines de canal transmembranaire modifiées, également connues sous le nom de protéines nanopore ou protéines "Reader". Ces protéines sont essentielles au fonctionnement du séquençage par nanopore. Étant donné l'activité biologique de la protéine Reader, la puce doit être conservée au réfrigérateur à une température comprise entre 4 et 8 °C et placée loin des parois du réfrigérateur pour éviter le gel dû à des températures locales plus basses.

Séquençage direct de l'ADN ONT Shangqian (Xie et al., 2021)

La structure de membrane artificielle intégrée de protéines présente des propriétés insolubles. Ainsi, lorsqu'un champ électrique externe est appliqué, le courant électrique est transmis uniquement à travers les nanopores. Différentes tensions appliquées de chaque côté de la membrane créent un différentiel de tension, entraînant le déroulement et la translocation de l'ADN sous l'influence de la protéine motrice, à travers le nanopore. À ce stade, des nucléotides individuels induiront des changements spécifiques du courant ionique. Cette membrane présente des caractéristiques de haute résistance électrique. En appliquant un potentiel à la membrane immergée dans une solution électrochimique, un courant ionique peut être généré au niveau du nanopore.

Le courant électrique passe à travers un nanopore. (Crédit : Oxford Nanopore Technologies)

Séquençage direct de l'ADN ONT (Shangqian Xie et al., 2021)

Étant donné que les molécules d'acides nucléiques présentent un degré élevé de désordre lors de l'écoulement de courant contrôlé dans une direction dans leur état non traité, cela n'est pas propice au séquençage. Par conséquent, comme d'autres méthodes de séquençage à haut débit, le séquençage par nanopores nécessite également la construction d'une bibliothèque.

Deux brins de l'adaptateur de bibliothèque sont connectés séparément à la protéine motrice et à un adaptateur en Y. L'adaptateur en Y interagit avec le bras de connexion sur la membrane, aidant à positionner la bibliothèque sur le nanopore. La protéine motrice sur l'adaptateur, en interaction directe avec la protéine du nanopore, aide à positionner la bibliothèque pendant le séquençage. Elle facilite le déroulement de l'acide nucléique et régule le taux de translocation à travers le pore.

Résumé

Évidemment, le signal initial collecté par les nanopores est un signal électrique. Étant donné que le signal est lié à la taille moléculaire dans le pore du canal, diverses informations de modification sur l'acide nucléique restent préservées dans le signal électrique. En fin de compte, le séquenceur stocke le signal électrique sous forme de fichiers 'fast5'. Après le processus d'identification des bases, les fichiers 'fast5' sont convertis en fichiers 'fastq', qui contiennent la séquence de bases ATCG.

Les bases de nanopore sont lues en unités de cinq bases par signal électrique, ce qui diffère des méthodes de synthèse pendant le séquençage. Par conséquent, strictement parlant, les valeurs Q, utilisées pour l'évaluation de la qualité du séquençage de deuxième génération, ne sont pas applicables au séquençage par nanopore. La définition de la valeur Q est la probabilité qu'une erreur se produise pour chaque base mesurée. Par conséquent, évaluer le séquençage par nanopore en utilisant une seule valeur de qualité de base est inapproprié. Le séquençage par nanopore utilise son propre ensemble unique de normes de contrôle de qualité, appelées précision de consensus.

Il convient de noter que la précision des nanopores s'améliore continuellement. En 2023, le nouveau réactif Q20 garantit que la précision médiane du séquençage dépasse 99 %. De même, le séquençage à haut débit n'est pas une norme absolue. Il détermine finalement la base à un locus donné en évaluant la profondeur de séquençage à ce locus.

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