Séquençage par nanopores : principes, plateformes et avantages

Histoire du séquençage de l'ADN

Au cours des cinquante dernières années, un certain nombre de chercheurs se sont consacrés au développement de la technologie de séquençage de l'ADN. Cette période a été marquée par des changements drastiques, passant de courts oligonucléotides à des millions de bases, du séquençage de gènes uniques à séquençage du génome entier, de la séquençage à lecture courte au séquençage à lecture longue, et du séquençage de première génération au séquençage de troisième génération. La technique de « terminaison de chaîne » ou dideoxy développée par Sanger en 1977 est l'une des percées qui a changé à jamais le progrès de la technologie de séquençage de l'ADN. Alors que le séquençage de première génération ne produit que des lectures légèrement inférieures à un kb de longueur, le séquençage de nouvelle génération (NGS) tel que Roche 454 et Illumina (séquençage massivement parallèle) a considérablement augmenté la quantité d'ADN dans une seule course de séquençage. Les techniques de séquençage de troisième génération sont apparues, caractérisées par des molécules uniques, en temps réel et à lecture longue. Les plus importantes parmi elles sont Séquençage SMRT de PacBio et séquençage par nanoporesParmi ces techniques, le séquençage par nanopores est celle qui est la plus attendue pour atteindre les normes d'or. Pour une compréhension complète, veuillez vous référer au chapitre intitulé "Principe du séquençage par nanopore .

Figure 1. L'histoire de la technologie de séquençage de l'ADN.

Séquençage par nanopore et plateformes

Oxford Nanopore Technologies (ONT) est la première entreprise basée sur le séquençage par nanopore et a suscité beaucoup d'enthousiasme grâce à ses plateformes de nanopore comme le MinION.^TM, GridION^TM, et PromethION^TM. Alors que MinION^TM est un petit appareil portable lancé en 2014, GridION^TM et PromethION^TM offrent respectivement 5 et 300 fois le rendement de MinION^TM. Flongle^TM est un adaptateur pour le MinION^TM et GridION^TM Dispositifs de séquençage X5, produisant jusqu'à 1,8 Go de données avec une marge pour plus de 3 Go.

Figure 2. Plates-formes de séquençage par nanopores chez ONT.

Un nanopore est un trou à l'échelle nanométrique. Les plateformes de nanopores utilisent des protéines formant des pores pour créer des pores dans des membranes (nanopores biologiques) ou utilisent des nanopores fabriqués à partir de matériaux synthétiques (nanopores à l'état solide). Les plateformes Oxford Nanopore font passer un courant ionique à travers les nanopores et mesurent les variations de courant lorsque des molécules biologiques passent à travers le nanopore ou à proximité. Les variations sont documentées et traduites pour identifier cette molécule et modifier la base.

Figure 3. Illustration schématique d'un dispositif de séquençage par nanopore.

Les avantages du séquençage par nanopore

Le séquençage par nanopore représente une technologie robuste dans le domaine du séquençage de l'ADN, produisant des données de séquence à lecture incroyablement longue, à un coût et une vitesse bien supérieurs à ce qui était possible auparavant.

• Séquençage à lecture longue

Un avantage majeur du séquençage par nanopores est la capacité de produire des lectures ultra-longues, avec des longueurs de lecture dépassant 2 Mb. Les longueurs de lecture ultra-longues sont plus susceptibles de couvrir des régions entières de séquences répétitives et de variations structurelles, offrant une vue plus complète des variations génétiques et la possibilité de reconstruire des génomes complexes.

• Séquençage direct de l'ARN

Les approches traditionnelles de séquençage de l'ARN nécessitent la conversion de l'ARN en cDNA, ce qui peut introduire un biais lors de la transcription inverse ou de l'amplification. Le séquençage par nanopore peut séquencer directement des molécules d'ARN, offrant un séquençage de l'ARN sans biais, en longueur complète et spécifique à la brin. Le plus long transcript séquencé par séquençage par nanopore mesure actuellement plus de 20 kb de longueur. Le séquençage direct de l'ARN apporte également l'avantage d'une mesure précise de la longueur de la queue poly-A.

• Méthodologies de séquençage ciblé

Le séquençage ciblé, axé sur des gènes/régions spécifiques, peut fournir des données pertinentes, tout en réduisant les coûts, en augmentant la profondeur de couverture et en simplifiant l'analyse des données. Une gamme de méthodologies de séquençage ciblé utilisant à la fois des stratégies d'enrichissement ciblé basées sur la PCR et la capture hybride est disponible pour le séquençage par nanopore, telles que les panneaux ciblés et l'enrichissement de l'exome entier. Le séquençage par nanopore permet de séquencer des régions beaucoup plus grandes (y compris des régions répétitives) en une seule lecture.

• Détection simultanée des séquences et des modifications de bases

Les modifications de base comme 5mC et m6A sont très importantes dans l'expression et la fonction des gènes. Épigénomique est un domaine axé sur les modifications de bases. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) nécessitent des processus supplémentaires, tels que le traitement au bisulfite, pour l'analyse des modifications de bases. Cependant, le séquençage par nanopore, qui ne nécessite pas d'amplification PCR ni de synthèse de brin, peut détecter simultanément à la fois la base et sa modification (y compris m6A, pseudouridine, 5mC et m7G) dans le même cycle de séquençage.

Références :

1. Heather J M, Chain B. La séquence des séquenceurs : l'histoire du séquençage de l'ADN. Génomique, 2016, 107(1) : 1-8.
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