Application de la technologie de séquençage par nanopores

Séquençage par nanopore la technologie présente plusieurs avantages notables, notamment, en termes généraux, de longues longueurs de lecture, un rendement élevé, une portabilité, un fonctionnement en temps réel, une facilité d'utilisation et des capacités de lecture directe. Une explication plus détaillée de ces avantages peut être trouvée dans l'article "Pourquoi choisir le séquençage par nanopores ?". Ces caractéristiques rendent cette technologie extrêmement précieuse dans le domaine de la génomique ou analyses transcriptomiquesCe document vise à fournir une liste de cas d'utilisation typiques de Séquençage par nanopore technologie dans des applications réelles en tant que références pour les lecteurs.

Séquençage par nanopore trouve des applications dans divers domaines de recherche : assemblage de génomes (par exemple, niveau Mb) séquençage à lecture longue), détection directe des modifications de bases (par exemple, séquençage ADN/ARN), séquençage ciblé au niveau des chromosomes et séquençage en temps réel rapide des métagénomes (détection de microorganismes pathogènes).

Assemblage de génome large

L'une des caractéristiques les plus distinctives de la technologie de séquençage par nanopore est sa capacité à séquençage à lecture longueun avantage crucial dans l'assemblage de grands génomes. Dans le passé, l'assemblage de génomes basé sur de courts fragments posait des défis significatifs, en particulier pour les organismes présentant des caractéristiques telles que la polyploïdie, des répétitions étendues et une forte hétérozygotie. Pour certaines plantes comme Paris japonica avec une taille de génome de 152 Gb et le décaploïde Fragaria turupensis, l'assemblage par courtes lectures était insuffisant. Malgré l'introduction de techniques telles que les bibliothèques à grands inserts, les bibliothèques BAC, le mapping optique, le Hi-C et le bionano, les défis fondamentaux de l'assemblage de grands génomes persistaient. Le séquençage par nanopores, cependant, s'avère instrumental pour relever ces défis et améliore considérablement la complétude du génome.

Identification rapide des micro-organismes

Grâce aux caractéristiques en temps réel, rapides et compactes de la technologie de séquençage par nanopores, elle permet un séquençage direct, facilitant l'acquisition immédiate d'informations sur les séquences pour la classification et l'identification des espèces, permettant ainsi une reconnaissance microbienne rapide. Avec l'augmentation du débit de séquençage, la surveillance en temps réel a été largement appliquée aux agents pathogènes ayant des génomes plus grands, allant des virus de quelques kilobases (Kb) aux bactéries de quelques mégabases (Mb), et même aux agents pathogènes fongiques humains avec des génomes supérieurs à 10 Mb, tous pouvant être surveillés sur site et en temps réel.

Le processus et la représentation schématique du séquençage de l'ADNr 16S par nanopore. Le temps de réponse était d'environ 6 à 8 heures entre la collecte de l'échantillon et les résultats. (Yinghu Chen et al., 2023)

Détection de la résistance aux antimicrobiens dans les microorganismes pathogènes

L'émergence de la résistance aux antibiotiques par le biais de mutations génétiques chez les pathogènes pose un défi majeur pour le traitement clinique. Actuellement, le test de sensibilité aux antimicrobiens (TSA) est la méthode principale pour diagnostiquer la résistance aux médicaments microbiens. Cependant, les méthodes TSA standard présentent des limitations. Séquençage par nanopore La technologie excelle dans la détection des mutations dans les gènes résistants aux médicaments ciblés, offrant des conseils en temps réel pour le traitement clinique et servant de référence pour l'évaluation du pronostic des patients. La plateforme de séquençage à haut débit, à haute sortie et efficace fournit une valeur clinique cruciale pour atteindre une surveillance en temps réel.

Analyse du transcriptome complet

Historiquement, l'analyse du transcriptome impliquait le séquençage de l'ARNm après fragmentation et transcription inverse en ADNc. Dans ce processus, la PCR peut introduire un biais d'amplification, conduisant à l'identification de gènes différentiellement exprimés faussement positifs. Malgré l'utilisation actuelle de méthodes unicellulaires avec des codes-barres moléculaires pour réduire le biais de la PCR, l'obtention et l'analyse transcriptions intégrales reste un défi. En raison des variations de jonction prévalentes chez les eucaryotes, le séquençage à lecture courte peine à identifier avec précision. Cependant, l'utilisation du séquençage à lecture longue par nanopore permet l'identification précise de multiples isoformes pour chaque gène, offrant une approche simplifiée et précise.

En savoir plus : Séquençage de transcrits complets : Une comparaison entre PacBio Iso-Seq et Nanopore Direct RNA-Seq

Séquençage direct de l'ARN

La technologie de séquençage par nanopores se distingue comme la seule méthode capable de séquencer directement des chaînes d'ARN sans avoir besoin de transcription inverse ni d'amplification. Cette approche ne présente aucune préférence de séquençage et détecte avec précision les sites de méthylation sur les molécules d'ARN, tels que les modifications m6A et m5C. De plus, le séquençage par nanopores fournit une estimation relativement précise des longueurs des queues Poly(A), contribuant à la révélation des caractéristiques authentiques de l'ARN.

Détection directe des modifications et de la structure de l'ARN à l'aide du séquençage par nanopore à molécule unique. (William Stephenson) et al., Cell Genomics 2022)

Variations structurelles importantes

Les variations génomiques englobent les variants de nucléotides uniques (SNVs), les insertions et les délétions (Indels), ainsi que les variants structurels (SVs). Séquençage de l'exome complet (WES)La séquençage à lecture courte, basé sur le séquençage à court terme, présente des limitations dans la détection des variations structurelles avec un taux de détection inférieur à 50 %. Cela est attribué à l'instabilité du séquençage à lecture courte dans l'identification des régions répétitives et à sa difficulté à couvrir les zones à forte teneur en GC. Cependant, des recherches actuelles confirment l'importance de caractériser ces régions répétitives et variations structurelles en relation avec la santé humaine et des conditions pathologiques telles que le vieillissement, les troubles liés aux répétitions de trinucleotides, l'autisme, l'épilepsie et le cancer. Par conséquent, l'identification et la caractérisation de ces variations de manière routinière revêtent une importance capitale. La technologie de séquençage par nanopores, avec ses avantages de lectures ultra-longues (actuellement jusqu'à 2,4 Mo), l'absence de biais GC et la détection directe de la méthylation, surmonte les défis rencontrés par le séquençage à lecture courte dans l'identification des SVs génétiques en s'étendant à travers les séquences répétitives.

Analyse du haplotype de mutation

L'analyse des haplotypes, également connue sous le nom de phasage, traite fondamentalement des informations sur les allèles dans les génomes diploïdes ou polyploïdes, en distinguant leurs origines parentales. Cela garantit que les informations provenant du même parent sont ordonnées sur les chromosomes respectifs. Il est clair que l'augmentation de la longueur de séquençage a des implications positives pour l'analyse des haplotypes (surtout lorsqu'il s'agit de chromosomes complets, permettant un alignement direct). Selon la littérature, l'application de lectures ultra-longues double non seulement la continuité des assemblages (NG50 ~ 6,4 Mo) mais améliore également de manière significative l'efficacité du phasage des gènes alléliques. Par exemple, réaliser le haplotypage au sein d'un seul contig de 16 Mo, en particulier pour le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de 4 Mo, devient une perspective réalisable.

Assemblage du génome bactérien

Étant donné la taille relativement compacte des génomes bactériens, qui n'excède généralement pas 10 Mb, et leur structure principalement monomérique avec des séquences répétitives minimales, la capacité de lecture longue de la technologie des nanopores permet l'assemblage en une seule étape de génomes entiers en quelques minutes (selon l'échantillon spécifique et les configurations matérielles).

Les lectures de séquençage par nanopore améliorent l'assemblage et l'annotation des gènes de la Parochlus steinenii génome (Shin, S.C. et al., 2019)

Conclusion

Alors que les plateformes de séquençage à lecture longue, représentées par Séquençage par nanopore la technologie, peut présenter une précision inférieure par rapport aux plateformes de deuxième génération, leur émergence en tant que nouvelle technologie, la diversité des réactifs et l'absence de méthodes d'analyse standardisées y contribuent. Néanmoins, ces plateformes montrent des performances louables dans l'identification microbienne, la détection de pathogènes, la recherche oncologique et la détection de maladies génétiques. Malgré leurs limitations actuelles, un potentiel significatif d'avancement existe, offrant de nouvelles perspectives et techniques pour les disciplines scientifiques pertinentes. Séquençage par nanopore est prêt à déployer une plus grande valeur de recherche dans divers domaines.

Références :

1. Shin, S.C., Kim, H., Lee, J. et al.Les lectures de séquençage par nanopore améliorent l'assemblage et l'annotation des gènes de la Parochlus steinenii génome. Sci Rep neuf, 5095 (2019).
2. Yinghu Chen et al., Un ciblage amélioré de la méthode de séquençage par nanopore de l'ADNr 16S permet une identification rapide des pathogènes dans la pneumonie bactérienne chez les enfants. Front. Cell. Infect. Microbiol09 janvier 2023
3. William Stephenson. et al.Détection directe des modifications et de la structure de l'ARN à l'aide du séquençage par nanopore à molécule unique. Génomique cellulaire 2022