Stratégies pour le cartographie fine des SNP : Analyse de ségrégation en masse

Une population F2 à grande échelle peut être utilisée pour effectuer Analyse de ségrégation en vrac (BSA) pour le mapping initial. Par la suite, au sein des intervalles de mapping identifiés, des marqueurs de polymorphisme nucléotidique unitaire (SNP) peuvent être utilisés pour construire des cartes de liaison locales détaillées et réaliser un mapping de locus de traits quantitatifs (QTL). Cette approche améliore la précision dans la localisation des loci de traits cibles. De plus, l'intégration des données de séquençage du transcriptome pour une analyse conjointe facilite l'identification accélérée des gènes candidats. Cette méthodologie devrait dominer en tant que stratégie principale pour le fine-mapping dans un avenir prévisible.

Principes fondamentaux de l'analyse de ségrégation en vrac (BSA)

BSA, également connu sous le nom d'analyse de pools mixtes ou d'analyse de populations ségréguées, est une approche méthodologique qui consiste à sélectionner des individus présentant des phénotypes extrêmes ou représentatifs d'une population afin de créer des pools mixtes pour l'analyse. En examinant les différences de fréquences d'allèles ou de marqueurs moléculaires entre ces pools mixtes, des loci associés à des traits spécifiques peuvent être cartographiés sur le génome.

En comparaison avec les méthodes de recherche génétique traditionnelles, un avantage notable de l'analyse de l'association par le biais de la sélection (BSA) est qu'elle élimine le besoin de génotyper tous les individus d'une population. Au lieu de cela, elle se concentre sur l'analyse d'échantillons groupés provenant d'individus sélectionnés en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques. Cette approche réduit considérablement la charge de travail et les coûts associés à l'étude. Par exemple, dans une population de 500 individus, le génotypage de seulement deux pools parentaux et de deux pools de descendants peut suffire à compléter une analyse BSA (et même les pools de descendants seuls peuvent faciliter l'analyse BSA en l'absence de pools parentaux). De plus, à condition que le design expérimental soit solide, la fiabilité statistique de l'analyse BSA est comparable à celle des méthodes impliquant l'étude de tous les échantillons individuels.

De plus, la BSA ne repose pas exclusivement sur les technologies de séquençage. Elle peut être utilisée avec des marqueurs moléculaires, des microarrays et des méthodes de séquençage à haut débit à travers différentes couches biologiques, y compris l'ADN, l'ARN et les protéines. Cependant, à l'heure actuelle, des méthodologies complètes de BSA au niveau des protéines n'ont pas encore été entièrement établies. Par conséquent, les analyses de BSA sont principalement concentrées sur les couches d'ADN et d'ARN.

Analyse de séquençage par ségrégation en vrac

Uniformité des piscines

Pour le BSA, garantir l'uniformité au sein du pool est crucial. Cette uniformité implique que l'ADN séquencé doit être uniformément prélevé chez chaque individu. Il est donc recommandé d'extraire d'abord les acides nucléiques de chaque individu, puis de combiner ces extraits pour former le pool, plutôt que de mélanger les échantillons avant l'extraction des acides nucléiques.

Taille du pool et profondeur de séquençage

La taille du pool et la profondeur de séquençage sont tous deux des facteurs critiques qui influencent la précision du mapping des loci. Une augmentation de la taille du pool ou de la profondeur de séquençage améliore généralement l'exactitude de la localisation. Cependant, au-delà d'un certain seuil, des augmentations supplémentaires de la taille du pool et de la profondeur de séquençage entraînent des rendements décroissants en ce qui concerne l'amélioration de la précision de localisation. Pour les populations F2 conventionnelles, il est généralement nécessaire d'inclure plus de 30 individus par pool, avec une profondeur de séquençage de 20× pour les séquences parentales et de 1× par individu pour les pools de descendants.

Extrêmes de traits

Étant donné une taille de population fixe, la taille du pool doit être correctement limitée pour garantir que le pool représente fidèlement des traits extrêmes spécifiques. Si les traits sélectionnés ne sont pas suffisamment extrêmes, cela peut entraîner une localisation infructueuse. Pour améliorer la précision de la localisation en augmentant la taille du pool, il est nécessaire d'augmenter simultanément la taille globale de la population. Il est impératif d'éviter de mélanger des individus de différentes populations ayant des phénotypes similaires pour l'analyse BSA.

Flux de travail de l'analyse de ségrégation en vrac

Construction de la population : Les populations F1, F2 et BC1F1 sont établies.

Cartographie des Loci de Caractères Quantitatifs (QTL)Les QTL sont cartographiés dans la population F2. La validation des résultats de cartographie des QTL est effectuée à l'aide de lignées de descendants F2:3.

Ségréation QTLLes marqueurs moléculaires sont utilisés pour sélectionner des QTL cibles qui sont hétérozygotes. Des plantes individuelles BC1F1 sont identifiées où d'autres QTL sont homozygotes (un nombre suffisant d'individus BC1F1 est requis). L'autopollinisation subséquente produit des lignées de descendants BC1F1:2.

Sélection des phénotypes extrêmesDeux groupes phénotypiques extrêmes sont sélectionnés à partir de la population BC1F1:2.

Regroupement de phénotypes extrêmesL'ADN est extrait des groupes phénotypiques extrêmes sélectionnés et regroupé pour former deux pools extrêmes.

Séquençage et appel de variantsLe séquençage est effectué sur les deux échantillons regroupés. Les variants sont identifiés en alignant les données de séquençage contre un génome de référence.

Analyse d'associationUne analyse de l'indice SNP est réalisée (Takagi H, et al., 2013 ; Mansfeld BN, et al., 2018).

Pour des informations supplémentaires sur le flux de travail, référez-vous au «Flux de travail de la technologie BSA-seq"

Étude de cas : Cartographie rapide des QTL de hauteur des plants de maïs

Un maïs étude de population a été réalisé pour identifier des QTL associés à la hauteur des plantes. En utilisant quatre générations de matériaux de maïs, une population F2 ségréguante a été créée à partir de deux lignées pures, HZS et 1462, qui présentent des différences de hauteur significatives. La plage des hauteurs individuelles des plantes dans la population F2 variait de 199 cm à 307 cm, indiquant un caractère hautement ségrégeant, suggérant l'implication de plusieurs QTL dans le contrôle de la hauteur des plantes.

Méthodologie

Construction de la population :

La population F2 en segregation a été développée à partir des deux lignées pures HZS et 1462.

Cartographie des QTL :

Un total de 1 028 marqueurs polymorphes ont été utilisés pour identifier des QTL à effet majeur. Quatre QTL ont été cartographiés sur les chromosomes 1, 3, 6 et 7, avec une variation phénotypique expliquée (PVE) allant de 7 % à 17 %. Les résultats de la cartographie des QTL ont été validés à l'aide de lignées de descendants F2:3.

Cartographie fine de qPH7 :

Le QTL situé sur le chromosome 7, désigné comme qPH7, a été soumis à un cartographie fine en utilisant une stratégie QTL-seq. Parmi 813 plantes individuelles BC1F1 (hétérozygotes pour qPH7 et homozygotes pour les trois autres loci QTL), 15 plantes ont été sélectionnées, et des lignées de descendants BC1F1:2 ont été générées. La hauteur des plantes a été évaluée, ce qui a donné 3 120 plantes individuelles BC1F1:2. Celles-ci ont été divisées en deux groupes phénotypiques extrêmes : faible valeur (580 plantes) et haute valeur (567 plantes). L'ADN de ces groupes a été regroupé en pools faible et élevé, respectivement.

Séquençage à l'échelle du génome :

Séquençage du génome entier a été réalisé sur les échantillons regroupés (couverture > 280×), détectant 197 021 SNPs de haute qualité. Le génotypage des marqueurs a confirmé la localisation du pic entre 135,1 et 135,2 Mb. L'analyse utilisant les algorithmes smoothLOD et ED4 a révélé un seul pic sur le chromosome 7, situé à 135,3 Mb.

Identification des gènes candidats

Pour identifier davantage de gènes candidats, Analyse RNA-seq a été réalisée. L'analyse d'expression différentielle a montré que Zm00001d020874 présentait une expression différentielle significative entre le méristème apical de la tige (SAM) et les tissus des entre-nœuds juvéniles des lignées parentales. Sur la base des homologues fonctionnels dans Arabidopsis et du signal de cartographie smoothLOD, Zm00001d020874 est considéré comme un gène candidat pour qPH7. Des expériences ultérieures, y compris l'édition génique CRISPR et des essais d'interaction protéique, soutiennent le rôle de Zm00001d020874 en tant que gène contrôlant la hauteur des plantes.

Conclusion

L'étude démontre une approche efficace pour cartographier rapidement les QTL associés à la hauteur des plants de maïs et identifier des gènes candidats grâce à une combinaison d'analyses QTL-seq et RNA-seq. Les résultats contribuent à une meilleure compréhension du contrôle génétique de la hauteur des plantes et fournissent une base pour une validation fonctionnelle ultérieure.

Considérations et défis

Défis techniques dans le mapping des hybrides mutant-souche sauvage

Lors du processus de cartographie des intervalles en utilisant des mutants et des hybrides de type sauvage, certains défis techniques peuvent survenir. Par conséquent, cette approche doit être utilisée avec prudence ou évitée lorsque cela est possible en raison de ces complexités.

Considérations dans la BSA et le cartographie des gènes candidats

Lors de l'application de la BSA ou d'autres techniques de précision pour localiser des gènes candidats, il est essentiel de noter que l'absence de polymorphisme entre les lignées parentales dans une région spécifique n'indique pas nécessairement un faux positif dans l'intervalle cartographié. Les mécanismes régulateurs moléculaires sous-jacents à la variation phénotypique entre les espèces sont complexes et multifacettes. Cette variation peut être attribuée à plusieurs facteurs, y compris les SNP, les InDels, les mutations d'exons ou les variations dans les régions promotrices.

Il est courant de rencontrer des situations dans les études de cartographie et de clonage des gènes où les polymorphismes attendus ne sont pas évidents. Cependant, il existe des cas où la méthylation de l'ADN joue un rôle de régulation critique. Par exemple, lors du processus de vernalisations, les basses températures induisent des changements dans les états de méthylation de l'ADN, qui à leur tour régulent l'expression du gène FLOWERING LOCUS C (FLC), affectant finalement le processus de floraison chez les plantes (Sheldon et al., 2000 ; Berry et al., 2015).

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Référence :

1. Zhang H, Wang X, Pan Q, Li P, Liu Y, Lu X, Zhong W, Li M, Han L, Li J, Wang P, Li D, Liu Y, Li Q, Yang F, Zhang YM, Wang G, Li L. QTG-Seq Accélère le Cartographie Fine des QTL grâce à la Partition des QTL et au Séquençage du Génome Complet d'Échantillons de Ségrégants en Gros. Plante Mol2019 Mar 4;12(3):426-437.