Service RAD-seq

Le RAD-seq offre une méthode économique pour découvrir des variations génétiques et construire des cartes génétiques. CD Genomics propose des techniques avancées de RAD-seq, y compris le dd-RAD et le 2b-RAD, pour fournir des informations génomiques de haute qualité adaptées à vos besoins de recherche.

Qu'est-ce que le RAD-Seq ?

Le séquençage d'ADN associé aux sites de restriction (RAD-seq) est une méthode robuste pour analyser l'ADN génomique aux sites reconnus par des endonucléases de restriction spécifiques. Introduit à l'origine par Baird et al. en 2008, l'approche traditionnelle du RAD-seq implique une digestion de l'ADN génomique par une seule enzyme de restriction, suivie de l'ajout d'adaptateurs et d'une fragmentation aléatoire de ces fragments par sonication. Cette méthodologie produit principalement des séquences de lecture 1 qui s'alignent précisément avec les sites de reconnaissance de l'enzyme, tandis que les séquences de lecture 2 présentent une variabilité considérable en raison de la fragmentation aléatoire.

Le RAD-seq offre des avantages considérables dans les études impliquant des espèces sans génome de référence. L'un de ses principaux atouts est la réduction significative des coûts de séquençage par rapport à séquençage du génome entier, tout en fournissant une richesse de données de variation à l'échelle du génome. Ces caractéristiques rendent le RAD-seq particulièrement précieux dans diverses applications, telles que le développement de marqueurs moléculaires, la construction de cartes génétiques, le mapping des gènes et des loci de traits quantitatifs (QTL), études d'association à l'échelle du génome (GWAS), génétique des populationset la sélection moléculaire.

Variantes du RAD-seq, y compris le RAD à double digestion (dd-RAD), 2b-RAD, et le fragment amplifié de locus spécifique - RAD (SLAF-RAD), ont été développés pour répondre à différents besoins expérimentaux. Les différences entre ces techniques concernent principalement le nombre d'enzymes utilisées, la présence ou l'absence d'étapes de fragmentation aléatoire, et la conception d'adaptateurs avec ou sans codes-barres. Malgré ces variations, le principe fondamental reste constant : toutes impliquent la digestion du génome avec des enzymes de restriction et le séquençage des fragments résultants.

• dd-RADCette méthode utilise une combinaison d'enzymes de restriction rares et fréquentes pour digérer le génome, éliminant ainsi le besoin d'une étape de fragmentation ultérieure. Elle permet un contrôle plus précis de la taille des fragments et produit des résultats reproductibles.
• 2b-RADUtilise des enzymes de restriction de type IIB, qui produisent des fragments d'ADN de taille uniforme. Cette uniformité simplifie les processus en aval et améliore la cohérence et la comparabilité des résultats.
• SLAF-RADPartage des similitudes avec dd-RAD lors de l'étape de digestion, mais utilise des adaptateurs non spécifiques pendant la préparation de la bibliothèque. Cette approche vise à équilibrer la spécificité avec la flexibilité dans différents dispositifs expérimentaux.

Figure 1. Illustration étape par étape de cinq protocoles de préparation de bibliothèques RAD-seq. (Andrews et al., 2016)

À quoi sert le RAD-Seq ?

Le RAD-seq est un outil polyvalent utilisé dans une variété d'applications génomiques :

• Développement de marqueurs moléculaires : Utilisé pour découvrir des marqueurs génétiques essentiels pour les programmes de sélection et la recherche génétique.
• Cartographie génétique : Facilite la création de haute densité cartes de liaison génétique, permettant une analyse détaillée des liens génétiques et des modèles d'héritage.
• Cartographie des gènes/QTL : Aide à identifier les QTL et les gènes spécifiques associés à des traits particuliers.
• GWAS : Aide à identifier les variantes génétiques liées à des traits ou des maladies complexes au sein des populations.
• Analyse de la génétique des populations : Permet d'examiner la diversité génétique, la structure des populations et les relations évolutives entre les individus et les espèces.

Avantages de notre service RAD-Seq

• Fournit la distance génétique totale de la carte et est responsable de la localisation des traits pour les clients.
• Fournit aux clients des textes pour la section des méthodes de leurs articles, ainsi que des tableaux et des figures liés au projet.
• Stratégie de tarification flexible.
• Expérience approfondie dans l'analyse de grands génomes d'animaux et de plantes.
• Intégration d'une analyse génomique complète, offrant divers services de technologies omiques, y compris la génomique, la transcriptomique et l'épigénétique, ainsi que des solutions d'analyse génomique avancées et personnalisées.
• Des processus rationalisés avec des cycles de projet plus courts.
• Économies réalisées grâce à l'analyse conjointe des informations d'échantillons avec des bases de données publiques.

Flux de travail RAD-Seq

Le RAD-seq implique une série structurée d'étapes, y compris :

• Fragmentation de l'ADN génomique à l'aide d'endonucléases de restriction.
• Adapter P1 adjacents à l'ADN fragmenté.
• Agrégation et fragmentation aléatoire des segments clivés par des enzymes provenant de tous les échantillons.
• Élagage de fragments de dimensions appropriées (généralement dans la plage de 300 à 700 paires de bases).
• Ligation des adaptateurs P2 aux fragments sélectionnés.
• Mise en œuvre de l'amplification PCR pour l'enrichissement.

Le flux de travail du RAD-Seq chez CD Genomics implique plusieurs étapes clés :

Spécifications du service

Nos spécifications de service englobent principalement trois aspects : Exigences d'échantillon, Stratégie de séquençage et Analyse bioinformatique.

Exigences d'échantillon

1. Détection de variantes:

Quantité d'échantillon d'ADN : ≥ 3 µg.

Digestion avec EcoRI (GAATTC).

Profondeur de séquençage recommandée : ≥ 1X par échantillon (≥ 5X pour les échantillons d'assemblage).

2. Cartographie génétique:

Quantité d'échantillon d'ADN : ≥ 3 µg.

Profondeur de séquençage : Parents 2-5X, Descendants 0,8X par individu (F1, F2, etc., populations temporaires), 0,6X par individu (RIL, DH, etc., populations permanentes).

Applicable à : espèces haploïdes ou diploïdes, toutes les populations de cartographie (F1, F2 ; RIL, DH, etc.), avec des populations de 100 individus ou plus.

3. Évolution de la population:

Quantité d'échantillon d'ADN : ≥ 3 µg.

Profondeur de séquençage : ≥ 1X par individu (≥ 5X pour les échantillons d'assemblage).

Applicable à : Différentes sous-populations au sein d'espèces haploïdes ou diploïdes, divisions de sous-populations distinctes, individus représentatifs au sein de la même sous-population. Environ 10 échantillons par sous-population (pour les animaux ≥ 10, pour les plantes ≥ 15), avec un total d'au moins 30 échantillons.

4. Détails de l'échantillon:

Échantillons d'ADN : Veuillez fournir de l'ADN avec une concentration > 100 ng/μl et une quantité totale > 3 μg, rapport OD 260/280 entre 1,8 et 2,0.

Assurez-vous que l'ADN n'est pas dégradé, ne montre pas de bandes d'ARN significatives lors de l'électrophorèse et présente des bandes génomiques claires et intactes, avec la bande principale au-dessus de 100 kb. La contamination par des polysaccharides ou des glycoprotéines peut poser des défis importants à la fragmentation de l'ADN, rendant leur élimination difficile. Il est donc essentiel que les échantillons fournis soient exempts de contamination par des polysaccharides ou des glycoprotéines.

Échantillons de plantes : Sélectionnez des tissus de plantes jeunes, chaque échantillon pesant > 500 mg. Conservez et expédiez les échantillons sur de la glace sèche ou dans de l'azote liquide.

Échantillons animaux : Des tissus animaux frais sont nécessaires, en évitant les tissus graisseux, chaque échantillon pesant plus de 50 mg.

Pour les espèces communes, sélectionnez des tissus tels que le foie, les reins et le sang. Pour les espèces rares, fournissez des échantillons d'oreilles ou des échantillons de cheveux (avec racines) contenant moins de graisse. Pour minimiser l'impact de la variation individuelle sur l'assemblage ultérieur, il est préférable de prélever des échantillons du même individu. Si les espèces sont de petite taille et que la quantité d'ADN extraite d'un individu est insuffisante pour le séquençage, essayez de réduire le nombre d'individus prélevés tout en maintenant la quantité requise. Fournissez des échantillons de tissus de > 50 mg ; fournissez une quantité suffisante, en tenant compte du fait que différentes espèces peuvent donner des quantités d'ADN variables lors de l'extraction.

Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Stratégie de séquençage

Analyse bioinformatique

• Développement de marqueurs moléculaires : Identification de SNPs individuels, identification de marqueurs InDel individuels, intégration de marqueurs SNP de population.
• Cartographie génétique à haute densité : différenciation des groupes de liaison, ordonnancement d'un grand nombre de marqueurs et dépistage des loci de ségrégation biaisée.
• Analyse de la génétique des populations : Réalisation d'analyses génétiques de population à partir de données SNP, y compris la construction d'arbres, l'analyse de la structure des populations et l'analyse en composantes principales (ACP).
• Cartographie des croquis génomiques : Assemblage de croquis génomiques et annotation des gènes.

Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse de données
• Détails dans RAD-seq pour votre écriture (personnalisation)

Référence

1. Andrews KR, Good JM, Miller MR, et al. Exploiter la puissance du RADseq pour la génomique écologique et évolutive. Nature Reviews GénétiqueFévr. 2016 ; 17(2) : 81-92.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont montrés ci-dessous :

FAQs sur le RAD-seq

Q : Quelles considérations sont primordiales dans le développement de marqueurs SNP à haute densité ?

A : Les prérequis essentiels et les principes directeurs pour le développement de marqueurs SNP à haute densité tournent autour de l'impératif d'atteindre une distribution équilibrée des fragments à travers le génome. En identifiant des séquences qui représentent fidèlement des informations génomiques complètes, une gamme de milliers de marqueurs SNP peut être systématiquement générée. Dans les premières étapes, des techniques de bioinformatique sont déployées pour évaluer méthodiquement le génome de référence de l'espèce cible (ou des séquences BAC connues). Guidés par des facteurs tels que le contenu en GC du génome, les caractéristiques des séquences répétitives et les attributs des gènes, des choix discernants d'enzymes de restriction appropriées et de types de bibliothèques de séquençage sont effectués, avec pour objectif principal de garantir que la densité, la cohérence et l'efficacité globale des marqueurs moléculaires s'alignent sur les exigences strictes de l'analyse génétique et de la sélection moléculaire.

Q : Quels sont les domaines d'application du RAD-seq ?

A : Le RAD-seq trouve une utilité polyvalente dans divers domaines de recherche, englobant l'établissement de cartes génétiques, l'analyse phylogéographique des polymorphismes, les études d'association et le mapping de QTL, indépendamment de la présence ou de l'absence de données de génome de référence pour une espèce donnée. La portée large de la technologie RAD-Seq s'étend aux investigations impliquant la découverte de variations, la construction de cartes génétiques, l'exploration de gènes fonctionnels et l'étude de l'évolution des populations.

Q : Quels sont les avantages de l'utilisation du RAD-seq dans le cadre des études sur l'évolution des populations ?

A : Évolution de la population Les études englobent généralement un nombre considérable d'échantillons. Le RAD-seq présente un ensemble d'avantages distincts à cet égard. Il réduit efficacement la complexité du génome, ce qui entraîne une diminution des dépenses liées à la préparation des bibliothèques et au séquençage. Son flux de travail simple rationalise le processus. De plus, son indépendance par rapport aux génomes de référence le rend applicable à un plus large éventail d'espèces. Il convient de noter que le RAD-Seq excelle dans les investigations impliquant de grandes tailles d'échantillons, fournissant ainsi un cadre solide pour l'extraction de données complètes grâce aux technologies de resequencement de génomes entiers.

Q : Qu'est-ce qui distingue l'utilisation d'un génome de référence de son absence ?

A : En ce qui concerne l'identification des informations mutationnelles, l'incorporation d'un génome de référence pour l'alignement des séquences et la détection des variations entraîne généralement des niveaux accrus d'efficacité et de précision. De plus, cela facilite la localisation précise de gènes spécifiques et permet des investigations sur le déséquilibre de liaison dans les populations.

Études de cas RAD-seq

Séquence et analyse du génome de la belle-de-nuit japonaise Ipomoea nil

Journal : Nature Communications

Facteur d'impact : 16,6

Publié : 08 novembre 2016

Contexte

Ipomée est un grand genre avec des espèces diverses, y compris l'I. nil (liseron du Japon) qui a une importance commerciale. Les chercheurs ont utilisé Illumina et Séquençage PacBio assembler un génome de 750 Mo d'I. nil, identifier les transposons Tpn1 et cartographier le gène du nanisme, CONTRACTED.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Séquençage de l'ADN et assemblage du génome

Une seule plante de TKS a été séquencée, révélant un génome de 750 Mb. Le séquençage PacBio a fourni de longues lectures et une couverture élevée, qui, combinées aux données Illumina, ont produit un assemblage avec un N50 de 3,72 Mb. Un assemblage alternatif uniquement basé sur Illumina était plus grand mais de qualité inférieure.

2. Détection de mauvaise assemblage et construction de pseudo-molécule

Les données RAD-seq ont aidé à corriger des erreurs d'assemblage, conduisant à une assemblage amélioré. Des pseudo-chromosomes ont été construits, couvrant 91,42 % du génome avec un N50 de 44,78 Mb.

Figure 1 : Caractérisations génomiques de Je. nul.

3. Validation de l'assemblage

L'assemblage a été validé par une analyse CEGMA et BUSCO, montrant une grande complétude, et soutenu par des alignements avec des EST et des séquences de fin de BAC, confirmant sa qualité.

4. Analyse et identification de Tpn1 Transposons

Le génome contenait 63,29 % d'éléments répétitifs, y compris des transposons Tpn1, dont certains étaient actifs et liés à des disruptions géniques chez les mutants.

Figure 2 : Le Tpn1 transposons familiaux codant des transposases.

5. Prédiction des gènes et annotation fonctionnelle

42 783 modèles de gènes ont été prédits, avec 79,12 % annotés, et les données RNA-seq ont fourni des informations fonctionnelles.

6. Analyse du gène nain CONTRACTÉ (CT)

Le gène CT, associé au nanisme et à la biosynthèse de BR, a été perturbé par des insertions de transposons chez les mutants, affectant l'expression génique.

7. Évolution du génome

L'analyse phylogénétique a révélé les relations étroites d'I. nil avec la tomate et le kiwi, avec des familles de gènes uniques et des événements de duplication génomique (WGD) distincts de ceux des Solanacées.

Figure 3 : Évolution du génome.

Conclusion

L'étude a utilisé des outils de séquençage avancés pour produire un assemblage génomique de haute qualité d'Ipomoea nil, améliorant significativement les longueurs de scaffolds et la résolution des répétitions. Elle a identifié des gènes clés et des transposons liés aux traits des plantes et aux mutations, et a souligné l'impact des duplications de génome entier sur l'évolution des plantes. Ce travail soutient les recherches futures et la génomique comparative dans l'ordre des Solanales.

Référence

1. Hoshino A, Jayakumar V, Nitasaka E, et al. Séquence génomique et analyse de la belle-de-nuit japonaise Ipomoea nil. Communications Nature. 2016 Nov 8;7(1):13295.