Qu'est-ce que la pharmacogénomique ?

Pharmacogénomique

La pharmacogénomique représente un domaine de pointe fusionnant la pharmacologie moléculaire et la génomique fonctionnelle, émergent à la fin des années 1990. Son objectif principal est d'améliorer l'efficacité et la sécurité des médicaments tout en analysant l'impact des variations génétiques sur les réponses individuelles aux traitements, affinant ainsi l'utilisation rationnelle des produits pharmaceutiques.

Un résumé des mécanismes par lesquels la variation génomique peut influencer la pharmacocinétique et/ou la pharmacodynamique d'un médicament, avec des exemples de paires médicament-gène cliniquement pertinentes. (Rollinson et al., 2020)

L'histoire de la pharmacogénomique

La pharmacogénomique trouve ses origines en 1957, lorsque Arno Motulsky de l'Université de Washington et Werner Kalow de l'Université de Toronto ont postulé que les variations génétiques dans l'activité enzymatique parmi les individus pouvaient conduire à des réponses diverses, voire contrastées, aux médicaments. Cependant, ce n'est qu'en 1997 que des avancées significatives ont été réalisées dans la compréhension du rôle des enzymes cytochrome P450 (CYP450) dans le métabolisme des médicaments. Un professeur associé de pharmacie à l'Université de Washington a découvert que, pour la plupart des médicaments, l'activité des CYP450 détermine à la fois la durée et la concentration de la présence du médicament dans le corps. Six cytochromes distincts—CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 et CYP3A4—jouent des rôles cruciaux dans le métabolisme des médicaments, avec des corrélations notables identifiées entre les polymorphismes de CYP2C9, CYP2C19 et CYP2D6 et les variations interindividuelles.

En 1997, Genset et Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) ont conclu un accord pour développer et promouvoir conjointement des kits de diagnostic génétique visant à évaluer l'efficacité des médicaments chez les patients, marquant un moment clé dans l'avancement de la pharmacogénomique. Le terme "pharmacogénomique" a été introduit en 1999, marquant la reconnaissance formelle de ce domaine en plein essor. Depuis lors, des recherches continues ont progressivement élucidé la relation complexe entre les polymorphismes génétiques et les variations individuelles dans la réponse aux médicaments, soulignant le potentiel transformateur de la pharmacogénomique dans la médecine personnalisée.

Applications de la pharmacogénomique

La pharmacogénomique explore l'interaction complexe entre les informations génomiques humaines et les réponses aux médicaments, visant à déchiffrer les causes sous-jacentes des variations individuelles dans l'action des médicaments. En s'appuyant sur des connaissances génomiques, la pharmacogénomique s'efforce d'ouvrir la voie au développement de nouveaux médicaments et à la réalisation de régimes médicamenteux sur mesure adaptés aux besoins individuels. Ces variations englobent un éventail de facteurs, y compris la sensibilité individuelle aux médicaments, les taux métaboliques et la susceptibilité aux réactions indésirables ou à la toxicité.

Les domaines clés d'intérêt dans la pharmacogénomique incluent :

• Prédiction de la sensibilité aux médicaments : Grâce à l'évaluation des marqueurs génétiques, la pharmacogénomique s'efforce de prévoir la sensibilité d'un individu à des médicaments particuliers, améliorant ainsi la prédiction de l'efficacité des médicaments.
• Prédire le taux métabolique : En examinant le rôle des enzymes de métabolisme et des transporteurs codés par des variations génétiques, la pharmacogénomique vise à prédire le taux auquel un médicament est métabolisé dans le corps. Cette compréhension aide à optimiser les schémas posologiques adaptés aux profils métaboliques individuels.
• Anticiper les réactions indésirables aux médicaments : la pharmacogénomique vise à identifier les marqueurs génétiques associés aux réactions indésirables aux médicaments, facilitant ainsi l'évitement ou l'atténuation des complications potentielles liées aux médicaments.

En essence, la pharmacogénomique promet de révolutionner le domaine de la médecine en ouvrant une ère de thérapeutiques personnalisées, où les traitements sont précisément adaptés à la composition génétique individuelle, maximisant ainsi l'efficacité tout en minimisant les effets indésirables.

Pharmacogénomique : Comprendre son impact sur les effets des médicaments

polymorphismes génétiques. polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs).

Le Projet Génome Humain a révélé que les séquences génétiques des individus diffèrent d'une seule unité sur mille, ce qui entraîne environ 3 millions de variantes. Ces variantes, ou polymorphismes, se produisent à un rythme d'environ une variante pour 500 à 1000 bases dans le génome, donnant lieu à des génotypes distincts qui dictent la susceptibilité des individus aux maladies et leurs réponses uniques aux médicaments.

Les SNPs, représentant des variations d'un seul nucléotide au sein de la séquence d'ADN, se produisent à une fréquence dépassant 1 % dans la population. Lorsqu'un nucléotide, tel que A, est substitué par l'un des trois autres nucléotides (C/T/G), cela donne lieu à des SNPs, représentant les plus petites différences génétiques entre les individus. Fait remarquable, 90 % de la diversité génétique humaine est attribuée aux SNPs, la pharmacogénomique analysant de manière approfondie les différences interindividuelles en matière de médicaments sous l'angle des SNPs.

La recherche en pharmacogénomique se concentre principalement sur quatre catégories de gènes liés aux médicaments : (1) les enzymes impliquées dans les voies de métabolisme des médicaments, (2) les récepteurs (protéines cibles) qui interagissent avec les médicaments, tels que l'ADRB2, (3) les canaux de transporteurs de médicaments, comme le gène MDR1, et (4) les protéines liées à la signalisation. Il convient de noter qu'une proportion significative—59%—des réactions indésirables aux médicaments provient de polymorphismes génétiques dans les enzymes de métabolisme des médicaments.

Technologies de la pharmacogénomique

Avec les avancées en génomique et la mise en œuvre de diverses initiatives basées sur le génome, la faisabilité des tests pharmacogénétiques a été fermement établie grâce à la conception de sondes ciblant des gènes liés aux médicaments et à la validation clinique qui a suivi. L'identification des variations génétiques englobe de nombreuses méthodes, largement classées en deux approches principales.

La première catégorie comprend des méthodes traditionnelles reposant sur l'électrophorèse sur gel, y compris le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (PCR-RFLP), le polymorphisme de conformation des brins simples (PCR-SSCP), l'électrophorèse sur gel en gradient de dénaturation (PCR-DGGE) et la PCR spécifique aux allèles (AS-PCR). Ces méthodes sont utilisées depuis longtemps dans l'analyse génétique, mais peuvent être laborieuses et chronophages.

En revanche, la deuxième catégorie englobe le séquençage à haut débit et l'automatisation, représentant des développements plus récents dans l'analyse génétique. Des techniques telles que le séquençage de Sanger, la détection par microarray d'ADN, le séquençage de nouvelle génération, la chromatographie liquide à haute performance par dénaturation (DHPLC) et la spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) offrent un débit et une automatisation accrus, rationalisant le processus d'analyse génétique. Ces méthodes avancées permettent un dépistage rapide et efficace des variations génétiques, facilitant l'adoption généralisée des tests pharmacogénétiques dans la pratique clinique.

De tests réactifs à des tests préventifs

Les tests réactifs présentent des inconvénients significatifs, principalement centrés sur les retards de prise de décision inhérents au processus de test. Ce retard peut conduire à des choix de traitement inappropriés, pouvant entraîner une toxicité médicamenteuse ou une inefficacité. Par exemple, l'administration de clopidogrel chez des patients ayant subi une PCI d'urgence sans connaissance préalable de leur génotype CYP2C19 souligne ce problème. En revanche, les tests préemptifs garantissent que les résultats des tests pharmacogénétiques sont facilement accessibles dans le dossier médical du patient avant la prescription. Cette approche proactive englobe à la fois les tests à gène unique et, plus particulièrement, les tests par panel ou par exome entier, englobant plusieurs gènes pharmacogénétiques exploitables.

Comparé aux tests réactifs à gène unique, les tests préemptifs à panel multigène offrent plusieurs avantages. Tout d'abord, ils améliorent l'efficacité en évitant la nécessité de multiples échantillons de patients et d'isolations d'ADN, un seul panel pharmacogénétique suffisant. Deuxièmement, ils éliminent les retards thérapeutiques, car les résultats des tests sont déjà intégrés dans le dossier médical du patient au moment de la prescription. Notamment, les tests préemptifs à panel poly-génique accélèrent encore davantage les décisions de traitement en intégrant préventivement les résultats des tests dans les dossiers des patients, ce qui évite d'attendre le retour des résultats. Il est important de noter que les tests pharmacogénomiques sont généralement une démarche unique, les résultats individuels étant récupérables au besoin dans des scénarios médicaux ultérieurs.

Actuellement, l'adoption de technologie NGS Les tests en pharmacogénomique restent limités en raison des coûts, de la complexité technologique et des défis d'interprétation des résultats. Cependant, l'accessibilité croissante et l'utilisation du séquençage à haut débit annoncent un avenir où les tests pharmacogénétiques, en particulier les tests préemptifs, deviendront courants.

Techniques de génotypage : PCR-RFLP

L'analyse par réaction en chaîne par polymérase / polymorphisme de longueur de fragment clivé par des endonucléases de restriction (PCR-RFLP) est couramment utilisée pour le génotypage des SNPs prévalents au sein des gènes. Cette méthode, bien qu'encore utilisée dans des contextes de recherche, présente des défis en termes de complexité et d'intensité de travail, la rendant inadaptée aux diagnostics cliniques de routine ou aux applications à haut débit. De plus, en raison de la nécessité de manipuler les tubes de réaction après la PCR et de traiter les amorces avec des enzymes de restriction, il existe un risque accru de contamination croisée par la PCR. Par mesure de précaution, une séparation physique entre la préparation des échantillons, la mise en place de la PCR et l'analyse post-PCR est impérative pour prévenir les résultats faussement positifs dus à la contamination.

• Principes de la PCR-RFLP

Bien que certaines variantes de séquence, telles que les changements d'une seule base, ne modifient pas la longueur de l'ADN, elles peuvent créer ou perturber des sites de reconnaissance pour les endonucléases. La PCR amplifie la séquence cible, après quoi le produit d'amplification subit une digestion avec des endonucléases de restriction pour déterminer les changements dans le site de restriction. L'état du site peut être discerné par électrophorèse sur gel du produit de digestion. Par exemple, un échantillon portant une variante qui perturbe le site de reconnaissance de l'enzyme produira un fragment PCR non coupé, contrairement à un échantillon ne possédant pas la variante, qui produit deux fragments plus courts. Dans les cas d'hétérozygotie (présence d'un allèle normal et d'un allèle variant), un long fragment et deux fragments plus courts sont observés. Ce test peut être conçu pour faciliter la différenciation des fragments via électrophorèse sur agarose.

PCR spécifique à l'allèle (AS-PCR)

La PCR spécifique à l'allèle (AS-PCR) tire parti des efficacités d'amplification disparates de deux amorces homologues ne différant que par leurs positions terminales 3', chaque amorce complétant précisément soit l'allèle normal, soit l'allèle variant. L'analyse des produits de réaction utilise généralement des méthodes basées sur des gels ou, plus couramment, la PCR en temps réel homogène utilisant des colorants fluorescents. Cette dernière est privilégiée pour sa commodité par rapport à l'électrophorèse. En général, la PCR AS basée sur des colorants fluorescents nécessite au moins deux réactions PCR par analyse de polymorphisme. De plus, l'AS-PCR repose sur l'optimisation de la sélectivité de la PCR pour garantir que le signal fluorescent, résultant de la liaison du colorant à l'amplicon, reflète avec précision le produit d'amplification attendu, exempt d'interférences provenant de réactions secondaires indésirables telles que la dimérisation des amorces.

Étant donné la préférence pour la détection directe des polymorphismes dans les diagnostics cliniques et la nécessité souvent requise de détecter plusieurs polymorphismes dans les tests de génotypage, diverses techniques multiplex ont émergé pour répondre à cette demande. Celles-ci incluent l'utilisation de sondes TaqMan, de sondes d'hybridation et de sondes Invader.

Probes TaqMan

Probes TaqMan sont largement utilisées dans les méthodologies de génotypage à locus unique et multiple, utilisant une approche PCR homogène basée sur des sondes pour la détection directe des variants. Parmi les diverses méthodes de détection des variants, le choix prédominant implique des sondes d'hydrolyse à nucléase 5', communément appelées sondes TaqMan. Ces sondes, distinctement marquées avec des marqueurs fluorescents, sont soigneusement conçues pour compléter parfaitement l'un ou l'autre des deux allèles variants différant par un ou plusieurs nucléotides.

Fonctionnellement, ces sondes doublement marquées sont initialement quenchées en raison de leur proximité dans la conformation de la sonde d'oligonucléotide. Lors de chaque cycle de PCR, la sonde TaqMan s'hybride avec sa région cible, et au cours de l'étape d'extension des amorces, le fluorophore rapporteur fluorescent et le fluorophore quenché se dissocient, émettant de la fluorescence lors de la clivage par l'activité nucléase 5' d'une ADN polymérase résistante à la chaleur (par exemple, Thermus aquaticus). Par conséquent, l'intensité de fluorescence, associée à chaque sonde TaqMan spécifique à un allèle, augmente régulièrement en temps réel avec chaque cycle d'amplification subséquent.

La détection des deux allèles, qu'ils soient dans un état pur ou hétérozygote, est généralement déterminée par des cycles au cours desquels le signal observable dépasse un seuil prédéfini (noté CT). Cependant, la capacité à génotyper plusieurs SNPs au sein d'une seule réaction PCR est davantage limitée par le nombre de signaux fluorescents distincts détectables dans une seule réaction que par la capacité de multiplexage à cibler plusieurs régions simultanément. Cette limitation dépend de facteurs tels que le chevauchement des spectres d'émission des colorants fluorescents utilisés pour le marquage des sondes, les capacités du matériel de détection et l'efficacité des logiciels de correction des interférences.

Plateforme de génotypage TaqMan

Probes de hybridation

Les sondes d'hybridation représentent une méthode robuste pour le génotypage fluorescent homogène, en particulier par l'analyse de la courbe de fusion post-PCR des sondes d'hybridation spécifiques aux allèles. Dans cette approche, deux sondes sont stratégiquement conçues pour chaque site SNP : la sonde d'ancrage se lie sélectivement aux séquences proches du site SNP, tandis que la sonde de détection SNP reconnaît spécifiquement la séquence contenant le SNP. En s'appuyant sur le principe du transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET), la sonde d'ancrage est marquée avec un colorant fluorescent donneur à une extrémité, tandis que la sonde de détection SNP porte un colorant accepteur à une extrémité. Les sondes sont conçues pour s'hybrider de manière optimale à une température propice à leur liaison adjacente sur le produit PCR, facilitant ainsi la génération de signaux fluorescents pendant et après la PCR.

La détection des SNP repose sur l'analyse des courbes de fusion, une technique qui discrimine entre différentes formes alléliques de l'ADN en fonction de leurs températures de fusion. Plus précisément, les sondes de détection des SNP sont conçues pour présenter des températures de fusion distinctes de celles des SNP de type sauvage et des SNP variants. À mesure que la température fluctue, la sonde se dissocie de la séquence cible à une température de fusion spécifique, en fonction de la composition allélique du SNP. Les profils de fusion résultants, uniques à chaque SNP, permettent la détection et la caractérisation des types de SNP.

Microarray génétique

Dans les techniques basées sur l'hybridation, le processus commence par l'isolement de l'ADN génomique, suivi de l'amplification par PCR de la région d'intérêt. Ensuite, la cible amplifiée est fragmentée à l'aide de l'enzyme DNase I et marquée à l'extrémité avec de la biotine. Ce produit marqué est ensuite soumis à une hybridation avec des oligonucléotides spécifiques d'allèles sur un substrat solide, tel que des billes ou des microarrays, dans des conditions strictes. Ces oligonucléotides spécifiques d'allèles, ne différant que par une ou deux bases, correspondent aux différents allèles du fragment d'ADN examiné. L'environnement de réaction est soigneusement contrôlé pour permettre l'élimination des cibles non appariées, garantissant que seuls les fragments d'ADN parfaitement hybridés restent, qui sont ensuite marqués par fluorescence. La fluorescence associée aux caractéristiques spécifiques de la sonde est détectée à l'aide d'un scanner confocal éclairé par laser.

Pour améliorer la spécificité de l'essai, plusieurs sondes sont souvent utilisées pour chaque allèle SNP. Les essais basés sur des puces d'oligonucléotides tirent généralement parti des signaux de fluorescence comparatifs entre des ensembles d'oligonucléotides parfaitement appariés et mal appariés pour détecter les polymorphismes tout en atténuant les effets de l'hybridation croisée. L'identification des polymorphismes, des allèles et des génotypes au sein d'un échantillon est facilitée par des logiciels et des algorithmes d'apprentissage, utilisant des échantillons avec des génotypes connus. Par exemple, cette méthodologie a été appliquée dans le développement de l'essai de génotypage AmpliChip CYP450.

Le microarray génétique Cette méthode permet la détection simultanée de presque tous les polymorphismes et allèles connus du CYP2D6 via des réactions de PCR longue multiplexées. Ces réactions amplifient le promoteur et la région codante du CYP2D6, ainsi que des réactions spécifiques adaptées pour détecter une délétion du gène CYP2D6 de 3,5 kb ou une duplication du gène CYP2D6.

Séquençage de Sanger

Séquençage de Sanger a révolutionné l'analyse génétique lors de son introduction par Sanger et al. en 1977. Au fil des ans, cette technologie a subi des améliorations et une automatisation significatives, culminant dans les plateformes de séquençage Sanger avancées d'aujourd'hui. Le séquençage Sanger moderne utilise des colorants fluorescents à quatre couleurs pour le marquage des ddNTP, associé à l'électrophorèse capillaire pour séparer précisément les fragments d'ADN. Ces avancées ont considérablement amélioré la commodité, la sécurité et le débit des procédures de séquençage.

Reconnu comme une méthode classique pour l'analyse des séquences d'ADN, le séquençage de Sanger est largement considéré comme la référence en matière de génotypage en raison de sa capacité à lire directement les séquences d'ADN. Cette polyvalence le rend adapté à la détection de diverses variations génétiques, y compris polymorphismes mononucléotidiques (SNPs), répétitions en tandem courtes (STRs), polymorphismes de séquence répétée Alu (ARPs) et typage HLA-B.

Notamment, plusieurs réactifs de diagnostic in vitro (DIV) de classe III basés sur le séquençage de Sanger ont reçu l'approbation d'agences réglementaires comme l'Administration nationale des produits médicaux (NMPA). Ces réactifs facilitent la détection des variations génétiques à des loci tels que UGT1A1, ALDH2, MTHFR, CYP2C19, CYP2C9, VKORC1, et d'autres, soulignant l'applicabilité répandue et l'utilité clinique du séquençage de Sanger dans le diagnostic moléculaire.

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

Séquençage à haut débitégalement connu sous le nom de séquençage de nouvelle génération (NGS) ou de séquençage massivement parallèle (MPS), représente un bond en avant révolutionnaire par rapport au séquençage de Sanger. Cette approche innovante tire parti du séquençage parallèle, permettant le séquençage simultané de millions, voire de milliards de fragments d'ADN, atteignant ainsi des objectifs de séquençage à grande échelle et à haut débit. Les technologies NGS commercialisées, telles que la technologie Solexa d'Illumina et la technologie Ion Torrent de Thermo, dominent le paysage des plateformes de séquençage à haut débit.

L'avantage principal du séquençage à haut débit réside dans sa capacité à atteindre un rendement remarquable tout en détectant simultanément diverses variations génétiques, y compris les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), les variations du nombre de copies (CNV), les répétitions en tandem courtes (STR), les répétitions Alu et le typage HLA-B. Cependant, cette méthode présente également plusieurs défis. L'instrumentation est coûteuse et les dépenses en réactifs peuvent être considérables. De plus, la complexité du processus de détection, couplée à des exigences strictes en matière d'installations de laboratoire et d'opérateurs qualifiés, pose des obstacles pratiques. En outre, l'analyse des données peut être complexe, entravant une adoption généralisée.

Séquençage à haut débit trouve une utilité particulière dans les applications impliquant la détection de variantes génétiques à travers plusieurs régions géniques ou l'identification de mutations présentes à faibles fréquences. Malgré ses complexités et ses limitations, le séquençage à haut débit se trouve à l'avant-garde de l'analyse génétique, stimulant les avancées dans le diagnostic moléculaire et les efforts de recherche.

Une représentation schématique du flux de travail en pharmacogénomique clinique décrit ici. (Giannopoulou et al., 2019)

En résumé

Ces dernières années, l'émergence des approches multi-omiques a révolutionné notre capacité à prévoir les maladies et à prédire les réponses aux médicaments, facilitant des stratégies de diagnostic et de traitement précises. Parmi ces technologies multi-omiques, la pharmacogénomique se distingue en élucidant l'interaction complexe entre l'information génétique et la pharmacocinétique/pharmacodynamique des médicaments (PK/PD) à travers Séquençage de l'ADN données.

Lorsqu'elles sont intégrées dans des études d'association à l'échelle du génome, la transcriptomique, la protéomique, l'épigénétique et la métabolomique détiennent un potentiel énorme pour découvrir les facteurs génétiques prédisposant les individus à des maladies multifactorielle et à des réponses variées aux médicaments. Cette approche globale permet l'identification précoce des populations susceptibles, ouvrant la voie à des interventions ciblées visant à améliorer la sécurité et l'efficacité des médicaments, tout en atténuant les effets indésirables.

De plus, la fusion de la protéomique et de la métabolomique renforce notre capacité à discerner les facteurs génétiques associés aux maladies multifactorielle et aux réactions médicamenteuses. En permettant des interventions précoces adaptées aux populations sensibles, cette approche intégrative favorise des thérapies médicamenteuses optimisées qui maximisent l'efficacité tout en minimisant la toxicité. En fin de compte, elle nous propulse vers la réalisation de traitements médicamenteux individualisés sûrs, efficaces et économiquement viables, favorisant ainsi une meilleure santé et un bien-être humain.

Références :

1. Rollinson, Victoria, Richard Turner et Munir Pirmohamed. "Pharmacogénomique pour les soins primaires : un aperçu." Gènes 11.11 (2020) : 1337.
2. Giannopoulou, Efstathia, et al. "Intégration du séquençage de nouvelle génération dans le flux de travail de la pharmacogénomique clinique." Frontières en pharmacologie 10 (2019) : 384.