Technologies de séquençage pour le point chaud de l'épigénomique microbienne – ADN N6-méthyladénine

La base modifiée la plus répandue dans l'ADN bactérien est N6-méthyladénine et implique des fonctions dans la régulation des processus de modification (RM), la réparation de l'ADN à brin nouvel, et le contrôle de l'expression génique. La virulence et les relations entre les bactéries et les cellules hôtes peuvent être causées par des mutations de méthyltransférases et une surexpression. Aucun enzyme n'est capable de déméthylater l'ADN m6A. in vivo, mais la liaison protéique compétitive sur les sites cibles peut influencer la méthylation et ainsi modifier la transcription dans les cellules nouvellement répliquées. Les mutations par décalage de cadre pourraient également entraîner des progrès dans l'expression génique impliquée dans la formation de la paroi cellulaire et restaurer des voies dans les régions répétées des gènes de méthyltransférase. Ces mécanismes de variation d'étape peuvent aider les bactéries à éviter les défenses des hôtes mammifères, mais il reste encore incertain si les décalages de cadre des méthyltransférases conduisent à une tolérance à d'autres conditions.

Avant l'avènement du séquençage à molécule unique, des digestions par restriction ou un séquençage après immunoprécipitation étaient utilisés dans des techniques pour évaluer la m6A dans l'ADN. Un test est utilisé pour différencier la cinétique de l'ADN polymérase impliquant des bases méthylées et des modèles pour des bases non méthylées, calculé en tant que période inter-pulsée (IPD) dans l'analyse en temps réel à molécule unique (SMRT) pipeline pour les résultats de séquençage PacBio. Divers groupes ont également montré que de légères améliorations des impulsions électriques lorsque l'ADN passe à travers des nanopores révéleront l'existence de modifications de bases à l'aide de séquenceurs produits par Technologies Oxford Nanopore (ONT).

Techniques pour le séquençage de la N6-méthyladénine

séquençage SMRTLe séquençage SMRT de PacBio dépend du séquençage par synthèse, dans lequel la séquence d'un modèle d'ADN circulaire est définie à partir de la série de pulsations de fluorescence, chacune provenant d'une polymérase fixée au fond d'un puits qui ajoute un nucléotide nommé. Par conséquent, les changements de bases ne modifient pas la séquence de base étiquetée, mais ils changent la cinétique de la polymérase. Les changements de bases peuvent être dérivés par le contraste d'un prototype modifié avec un modèle in silico ou un prototype non modifié en évaluant la longueur inter-pulsation. Par exemple, la présence de 6mA dans le brin modèle semble entraver l'intégration du T complémentaire par la polymérase. Les schémas de perturbation cinétique peuvent être plus compliqués et dépendre du contexte, tandis que l'ajustement des bases dépend souvent de la gravité des perturbations. Ces caractéristiques permettent au SMRT de détecter de manière très sensible 4mC et 6mA, ce qui le rend utile pour l'épigénomique bactérienne. Le séquençage SMRT a considérablement augmenté le nombre de méthyltransférases identifiées depuis 2012. Le séquençage SMRT a également été utilisé dans Leishmania pour diagnostiquer la base J (β-d-glucosyl-hydroxyméthyluracile) et a la capacité d'analyser des améliorations inexpliquées.

Séquençage par nanoporeLorsqu'un acide nucléique simple brin est resserré, le séquençage par nanopore ONT teste la différence de courant ionique à travers un nanopore biologique. Dans une méthode appelée appel de base, des réseaux de neurones convertissent la piste présente en nucléotides. Les modifications de l'ADN de base ajoutent des anomalies de signal brut, les rendant observables. Nanopolish est un kit d'analyse au niveau du signal pour les données de séquençage Oxford Nanopore qui peut identifier 5mCG avec un algorithme pré-entraîné. Étant donné que Nanopolish combine un modèle 5mCG, en plus de l'échantillon ciblé, il n'est pas nécessaire de séquencer une unité amplifiée par PCR et non modifiée. À une résolution presque de nucléotide unique, Nanopolish génère la probabilité qu'une base soit modifiée.

Trois mesures sont impliquées dans l'identification des modifications de bases lors du séquençage par nanopore : (1) l'appel des bases avec des bases canoniques, (2) l'attachement du signal brut à une référence génétique, et (3) l'évaluation de la preuve qu'une base est modifiée. Jusqu'à présent, le séquençage par nanopore performe mieux dans la détection de 5mCG, tandis que la précision de m6A est comparable à celle de PacBio. De plus, comparé à SMRT, le coût réduit par Go le rend idéal pour les génomes plus grands.

Références :

1. O'Brown, Z.K., Boulias, K., Wang, J. et al. Sources d'artéfacts dans les mesures de 6mA et d'abondance de 4mC dans l'ADN génomique eucaryote. BMC Genomics. 2019, 20, 445.
2. Quentin Gouil, Andrew Keniry ; Dernières techniques pour étudier la méthylation de l'ADN. Essais de biochimie. 2019, 63 (6) : 639–648.
3. Chuan-Le Xiao, et al. Le séquençage à résolution de nucléotides uniques de l'N6-méthyldeoxyadénosine humaine révèle des clusters asymétriques de brin associés à SSBP1 sur le génome mitochondrial, 2018.