Séquençage de l'ARNm vs Séquençage de l'ARN total

Le séquençage de l'ARN, également connu sous le nom de RNA-Seq, est une approche exceptionnellement puissante et globale pour examiner le transcriptome des cellules. Le processus de RNA-Seq tourne autour de la construction d'une bibliothèque d'ADN complémentaire (cDNA) pour le séquençage. Pour commencer la construction de la bibliothèque, l'ARN cellulaire est d'abord isolé, suivi d'évaluations de contrôle de qualité pour déterminer l'intégrité de l'ARN. Ensuite, l'ARN d'intérêt dans la bibliothèque peut être enrichi par des techniques d'élimination ou de dépistage, et par la suite, il subit une transcription inverse en cDNA avant le séquençage.

L'ARN-Seq trouve de vastes applications, allant des explorations fondamentales de la structure et de la fonction cellulaires à l'identification et à l'analyse de diverses conditions pathologiques dans des échantillons cliniques. Cette technologie permet la détection qualitative et quantitative de nombreux ARN dans des échantillons biologiques à des moments spécifiques. Par exemple, les modifications de l'expression génique avant et après une intervention thérapeutique peuvent être comparées pour déterminer la présence ou l'absence d'une maladie. De plus, l'ARN-Seq peut identifier des motifs d'épissage sélectifs, des modifications post-transcriptionnelles et des frontières exon-intron. Les données acquises offrent des aperçus inestimables sur les mécanismes cellulaires sous-jacents, la structure du génome, les effets causant des maladies, et bien plus encore.

Séquençage de l'ARN total

Le séquençage total de l'ARN, également connu sous le nom de séquençage de l'ensemble du transcriptome, est une méthode complète qui englobe le séquençage de toutes les molécules d'ARN, à la fois codantes et non codantes. Dans cette approche, l'ARN est séquencé après l'élimination de l'ARN ribosomique (ARNr), ce qui donne lieu à une collection diversifiée de molécules d'ARN. L'isolement initial de l'ARN total produit un mélange de divers ARN, tels que les ARNr, les ARN messagers précurseurs (pré-ARNm), les ARN messagers (ARNm) et différents types d'ARN non codants (ARNnc), y compris les ARN de transfert (ARNt), microARN (miARN), et de longs fragments de ARN non codants (lncARN) qui ne sont pas traduits en protéines (transcrits de plus de 200 nucléotides).

Différents sous-types d'ARN. (Cui et al., 2022)

RNA-Seq total offre des perspectives sur les ARN codants et les ARN non codants (par exemple, les lncARN et les miARN), fournissant des informations précieuses sur les régions régulatrices, les niveaux d'expression des transcrits, les motifs d'épissage et l'identification des exons, des introns et de leurs frontières.

Lors du séquençage, de nombreuses lectures de lncRNA peuvent chevaucher des ARNm. Il est à noter qu'environ 20 % des gènes du génome humain sont transcrits à partir de brins opposés, ce qui entraîne des régions de chevauchement. Par conséquent, des méthodes de séquençage total d'ARN spécifiques au brin sont nécessaires pour distinguer ces brins. Les techniques de séquençage spécifiques au brin permettent d'identifier le brin d'ADN spécifique (brin codant ou brin modèle) qui génère le transcript d'ARN. De plus, elles améliorent la précision des données d'expression génique en améliorant l'annotation des lectures de séquençage et en facilitant l'ajout de lectures de séquençage compatibles.

Pour améliorer la sensibilité du séquençage, l'ARNr, qui constitue 80 à 90 % de l'ARN total, est généralement éliminé par dé-biaisage. L'élimination des transcrits d'ARNr permet une plus grande concentration des lectures de séquençage sur les transcrits souhaités, augmentant ainsi la sensibilité du processus de séquençage. L'élimination de l'ARNr est particulièrement cruciale lorsque le niveau d'expression du transcrit cible est faible.

Séquençage de l'ARNm

mRNA-Seq est le choix préféré lorsqu'on se concentre sur la région codante des cibles eucaryotes. Cette méthode utilise une technique de criblage pour enrichir les ARN poly(adenylés) (poly(A)). Étant donné que les ARNm ne constituent qu'une petite fraction de l'ARN total, le séquençage uniquement des ARNm s'avère être l'approche la plus efficace et rentable si elle s'aligne avec l'objectif expérimental.

Contrairement à l'étape d'élimination de l'ARNr dans le séquençage de l'ARN total, le séquençage de l'ARNm repose sur un criblage par affinité Poly(A) pour enrichir l'ARNm. Les deux méthodes éliminent efficacement l'ARNr des échantillons. Le choix entre l'élimination de l'ARNr et l'enrichissement par Poly(A) dépend de divers facteurs, y compris la taille et le type d'échantillon (par exemple, procaryotes, animaux et plantes), chacun nécessitant des méthodes différentes.

Des méthodes d'enrichissement ou de suppression d'échantillons, telles que l'élimination des ribosomes ou l'enrichissement en ARNm, améliorent la qualité des données de séquençage dans les workflows Total RNA-Seq et mRNA-Seq. Ces approches permettent de séquencer des molécules d'ARN cibles tout en minimisant le gaspillage de lectures de séquençage.

Il est crucial d'identifier les informations souhaitées à partir des données RNA-Seq, car cela aide à exclure d'autres types d'ARN du processus de séquençage. Si l'accent est mis sur la région codante, l'mRNA-Seq est le choix approprié. Se concentrer sur les ARNm fournit des données d'expression génique supérieures, car ils ne constituent que 3 à 7 % du transcriptome des mammifères. Comparé au RNA-Seq total, l'mRNA-Seq permet une préparation de bibliothèque avec des tailles d'échantillons plus petites tout en augmentant la profondeur de séquençage.

Diagramme de flux et pipeline d'analyse des données mRNA-seq. (Zhao et al. 2016)

Les considérations budgétaires sont également importantes dans le choix de la méthode appropriée. Le séquençage de l'ARN total nécessite plus de données de séquençage (généralement 100 à 200 millions de lectures de séquençage par échantillon) et engendre des coûts plus élevés par rapport au séquençage de l'ARNm. Si seules les informations sur l'ARNm sont nécessaires, le séquençage de l'ARNm offre une plus grande profondeur de séquençage et des coûts inférieurs par rapport au séquençage de l'ARN total. Cela est dû au fait que les lectures de séquençage (généralement 25 à 50 millions de lectures de séquençage par échantillon) sont concentrées sur les molécules d'ARN enrichies en Poly(A). Pour les échantillons avec un matériel de départ limité, le séquençage de l'ARNm est la méthode la plus adaptée, fournissant de meilleures données de lectures de séquençage, des coûts inférieurs et nécessitant moins de matériel de départ.

Comment choisir le séquençage d'ARNm et le séquençage d'ARN total

Le choix entre les techniques de séquençage de l'ARN total (RNA-Seq) et de l'ARNm (mRNA-Seq) nécessite une réflexion approfondie sur l'objectif expérimental global, les problèmes biologiques potentiels et les limitations techniques. Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients uniques. Le séquençage de l'ARN total offre l'analyse transcriptomique la plus complète en capturant toutes les espèces d'ARN présentes dans l'échantillon, y compris les ARN non codants et les variantes d'épissage alternatif. En revanche, le mRNA-Seq se concentre spécifiquement sur les transcrits codant des protéines, fournissant des données supérieures sur les régions codantes des gènes.

En plus de l'objectif expérimental, plusieurs autres facteurs doivent être pris en compte. Le type d'échantillon joue un rôle crucial dans le choix de la méthode appropriée. Pour les échantillons avec un matériel de départ limité, tels que de petits échantillons de tissu ou des cellules uniques, le mRNA-Seq est souvent préféré en raison de sa sensibilité plus élevée et de sa capacité à travailler avec de faibles quantités d'entrée. Le Total RNA-Seq, en revanche, est plus polyvalent et peut traiter une gamme plus large de types d'échantillons, y compris l'ARN dégradé ou partiellement fragmenté.

Le volume de départ de l'échantillon doit également être pris en compte. Si le matériel de départ disponible est limité, le séquençage de l'ARNm peut être une option plus viable. En revanche, si un plus grand volume de matériel de départ est disponible, le séquençage de l'ARN total peut être effectué plus efficacement.

Le budget du projet est un autre facteur important. mRNA-Seq est généralement plus rentable car il se concentre sur une plus petite partie du transcriptome, tandis que le RNA-Seq total couvre l'ensemble du transcriptome et peut nécessiter un budget plus important.

De plus, il est crucial d'évaluer les limitations techniques et les exigences de chaque méthode. Le mRNA-Seq implique des étapes supplémentaires pour l'enrichissement en mRNA, ce qui peut introduire des biais. D'autre part, RNA-Seq total capture l'ensemble de la population d'ARN mais peut avoir une spécificité inférieure pour l'ARNm. Prenez en compte l'expertise et les ressources disponibles dans le laboratoire pour effectuer la méthode choisie.

En tenant compte de l'objectif expérimental, des problèmes biologiques potentiels, des limitations techniques, du type d'échantillon, du volume initial de l'échantillon et du budget du projet, vous pouvez prendre une décision éclairée sur l'utilisation de l'ARN total-Seq ou de l'ARNm-Seq pour vos besoins de recherche spécifiques. Il est également conseillé de demander l'avis d'experts ou de professionnels en bioinformatique pour s'assurer que la méthode la plus appropriée est choisie.

Références:

1. Cui, Lian, et al. "Modifications de l'ARN : importance dans la biologie des cellules immunitaires et les maladies associées." Transduction du signal et thérapie ciblée 7.1 (2022) : 334.
2. Zhao, Shanrong, et al. "Bioinformatique pour l'analyse des données RNA-seq." Bioinformatique - Caractéristiques et applications mises à jour : InTech (2016) : 125-49.