Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage de l'exome
Questions Générales
- Est-il nécessaire d'avoir un génome de référence pour le séquençage de l'exome entier ?
- Oui, si le génome de référence n'est pas disponible, la séquence de l'espèce étroitement apparentée doit être fournie, mais la fiabilité des résultats de capture ne peut pas être garantie. Parce que la sonde de capture est conçue sur la base de la séquence de référence fourni, il n'est pas recommandé si la région cible est connue pour avoir une grande divergence par rapport au ratio du génome de référence, comme une délétion d'insertion d'un grand fragment.
- Pourquoi le séquençage des exons doit-il être comparé avec l'ensemble du génome dans l'analyse, plutôt que directement avec la région cible ?
- D'abord, le région cible est généralement court par rapport à l'ensemble du génome et peut être discontinu, et si la région cible est extraite séparément, cela affectera l'effet de comparaison de séquence à la limite de la région. Deuxièmement, il est impossible d'évaluer la qualité de capture, comme le taux hors cible, le ratio sur cible, etc.
- Combien de fois la couverture est-elle généralement recommandée pour le séquençage de l'exome complet ?
- En général, 100× ou 150×. Un ploidie de couverture plus élevé, pour mesurer des variants génétiques hétérogènes, peut détecter un petit pourcentage de mutations. De plus, la couverture de séquençage de l'exome est aléatoire, de sorte qu'une couverture moyenne plus élevée aide à garantir que la plupart des régions disposent d'une couverture suffisante en ploïdie.
- Quelle est l'importance de la profondeur de séquençage de l'exome complet ? Comment la profondeur de séquençage est-elle convertie ?
- La profondeur de séquençage représente le nombre de fois que la séquence est couverte par l'ensemble de sondes. Plus ce nombre est élevé, plus l'identification des résultats de séquençage est précise et plus l'analyse statistique ultérieure est fiable. Pour les études sur les tumeurs et les mutations à faible fréquence, il est recommandé que la profondeur de séquençage soit d'au moins 150× ou plus. Si vous ne vous concentrez que sur les SNP classiques et les mutations non à faible fréquence, la profondeur de séquençage doit être d'au moins 30× ou plus. Méthode de conversion de la profondeur de séquençage : l'efficacité de capture de la région cible est généralement de 60-70%, la taille de la région cible de capture des exons est d'environ 60 Mo, c'est-à-dire que la profondeur de séquençage = 10G*60%/60Mo = 100×.
- Quelle taille de suppression de fragment peut être détectée par le séquençage de l'exome entier ?
- Environ 50 pb de suppressions de fragments peuvent être détectées. Étant donné que la couverture du séquençage de l'exome est très inégale, s'il y a de grandes suppressions, il est impossible de dire si c'est parce que l'hybridation ne les a pas capturées ou parce qu'elles sont manquantes. Ce qui peut être mesuré jusqu'à présent, c'est la suppression trouvée dans une lecture. La longueur d'une lecture est également de 150 pb, donc les suppressions de fragments inférieures à 50 pb peuvent être mesurées à partir de. séquençage des exons.
- La séquençage de l'exome complet peut-il être utilisé pour l'analyse des CNV ? Quelles autres méthodes sont disponibles pour la détection des CNV ?
- Le séquençage de l'exome entier a un processus de capture par hybridation, donc il y a un problème d'efficacité de capture par hybridation. L'efficacité d'hybridation de chaque exon est différente, et sa compétition homologue l'est aussi, donc la couverture des différents exons varie beaucoup. Par conséquent, en général, le séquençage des exons ne peut pas être utilisé pour la détection des CNV. Cependant, dans la recherche sur le cancer, les CNV peuvent être détectés en utilisant des contrôles de tissus cancéreux et paracancéreux. Il existe deux autres méthodes conventionnelles pour détecter les CNV, l'une est rééchantillonnage de l'ensemble du génome et l'autre est avec des microarrays SNP.
- La séquençage de l'exome entier peut-il être utilisé pour la détection de la méthylation dans des régions cibles ? La capture d'ARN peut-elle être réalisée ?
- La détection de la méthylation de la région cible peut être réalisée directement à l'aide d'un produit de séquençage par capture de méthylation. Le principe est similaire à celui du séquençage par capture cible, dans lequel une sonde spécialement conçue est utilisée pour capturer et enrichir la région cible d'intérêt pour l'enquêteur, puis séquencée et la méthylation détectée après traitement au bisulfite.
- Pouvez-vous prélever des échantillons avec un mélange de plusieurs espèces ?
- Oui, tant que le fragment cible capturé a un génome de référence correspondant, il peut être capturé par la sonde. Les exemples incluent des séquences virales intégrées dans le génome hôte, des séquences parasitaires mélangées dans le sang, des séquences microbiennes à faible abondance dans des échantillons environnementaux, etc. Étant donné que la proportion de ces séquences dans un échantillon mixte est souvent très faible, l'efficacité des méthodes de resequencement traditionnelles peut être très faible, nécessitant des volumes de séquençage très élevés pour obtenir une profondeur de couverture suffisante, tout en générant une grande quantité de données redondantes. Le séquençage par capture de cible présente un avantage certain à cet égard.
- Y a-t-il un indicateur de l'efficacité de la capture d'exons ?
- En raison des limitations de la technologie de séquençage, il existe certaines séquences dupliquées, des bases "N" indéterminées, la qualité des échantillons et d'autres facteurs qui peuvent ne pas être pris en compte.
- La capture d'exons peut-elle être réalisée sur des fragments avec un contenu élevé en GC ?
- Oui, mais il y aura un impact sur l'efficacité de capture de ces fragments. De même, les fragments de faible complexité et ceux avec des bases ambiguës sont également difficiles à capturer. Lors de la conception des sondes, les techniciens d'Euromonitor augmenteront le nombre de couverture et la densité des sondes en fonction de la couverture, et enverront les résultats de capture attendus au client pour confirmation. De plus, pour capturer des exons entiers, des UTR, etc., des ensembles de sondes pré-définis peuvent être utilisés. Ces sondes sont conçues pour optimiser les fragments qui sont plus difficiles à capturer et améliorer l'efficacité de capture correspondante.
- Qu'est-ce que l'efficacité de capture des exons ?
- Le séquençage des exons Le processus implique un processus d'hybridation. Il existe de nombreuses parties du chromosome humain qui sont homologues aux exons, et ces parties homologues sont également susceptibles d'être capturées lors du processus d'hybridation. Nous appelons le rapport de la partie des exons séquencés par rapport à toutes les séquences séquencées l'efficacité de capture. L'efficacité de capture n'affecte pas la qualité des données, mais uniquement la proportion effective des données.
- Quand choisir la capture d'exons complète ? Quand choisir une capture par sondes personnalisées ?
- Il existe des produits de sondes pré-définis pour les humains et certaines espèces communes pour la capture de tout l'exon, avec plusieurs versions de la sonde d'exon entier humain optimisées. Si la région cible est grande et que tous les exons (dizaines de Mb ou plus) sont concernés, il est recommandé de choisir la capture de tout l'exon directement, car les exons entiers sont mieux capturés avec un ensemble de sondes conçu de manière plus mature et à moindre coût. Pour des fragments cibles plus petits, ou pour des régions au-delà des exons qui sont également d'intérêt, des sondes personnalisées sont recommandées.
- Puis-je effectuer un séquençage par capture d'exons pour des espèces conventionnelles, des espèces avec des génomes nouveaux, imparfaits ou truffés d'erreurs ?
- Oui, il n'y a aucune restriction d'espèce sur le séquençage de capture ciblée Sur la plateforme, seules les informations sur la séquence du génome et la région cible sont nécessaires. Même si le génome de référence d'une espèce est relativement nouveau, inexact ou même très différent, le séquençage par capture peut être conçu. Cependant, en conséquence, les sondes de capture sont conçues sur la base des séquences fournies par le client, et par conséquent, l'exactitude des résultats ne peut pas être entièrement garantie.
- Les échantillons dégradés peuvent-ils être soumis à un post-banking ? Quelles sont les implications pour les données et l'analyse ultérieures ?
- Si les échantillons sont gravement dégradés, il n'est pas recommandé de construire une bibliothèque à risque et le taux de réussite de la construction d'une bibliothèque est faible ; si les échantillons sont gravement dégradés, l'impact de la construction d'une bibliothèque d'exome humain est principalement une faible efficacité de capture, un faible volume de données effectives et un faible taux de mappage correct.
Préparation d'échantillons
- Quel est l'impact de la viscosité de l'échantillon, de la contamination par des impuretés micellaires et de la contamination par l'ARN sur la construction de bibliothèques ? Quel est le taux de réussite approximatif de la construction de bibliothèques ?
- Cependant, si la contamination par des protéines et d'autres impuretés est grave, cela affectera la quantification et l'efficacité de l'enzyme dans la construction de la bibliothèque, ce qui réduira le taux de réussite de la construction de la bibliothèque ; la contamination par l'ARN affecte principalement la quantification des échantillons et le tri de l'ADN dans la construction de la bibliothèque ; par conséquent, si une contamination par l'ARN existe, une digestion de l'ARN est recommandée si la quantité totale et la qualité des échantillons sont adéquates.
- Une seule pièce de tissu peut-elle être co-extrait pour l'ADN et l'ARN ? Quelle est la méthode d'extraction ?
- Il existe deux méthodes de co-extraction, l'une consiste à couper le tissu en deux parties et à extraire l'ADN et l'ARN chacun ; l'autre consiste à utiliser un kit de co-extraction ADN/ARN pour extraire, mais généralement, l'ADN et l'ARN se dégradent facilement après l'extraction.
- Quelles sont les raisons du faible taux d'extraction d'ADN des échantillons FFPE ?
- Les échantillons FFPE sont généralement conservés pendant de nombreuses années et ont été sévèrement dégradés par le formaldéhyde ; de plus, les échantillons FFPE sont souvent précieux, donc les enseignants en envoient moins.
- Comment séparer les échantillons de plasma pour l'extraction de cf/ctDNA ?
- Prélever 5 mL de sang périphérique (généralement prélevé le matin ou tôt le matin), transférer rapidement dans un tube d'anticoagulant EDTA, inverser et mélanger délicatement (pour éviter l'hémolyse) ; séparer le plasma dans l'heure (à température ambiante) ou dans les 2 heures (à 4°C) : centrifuger à 1 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C, aspirer délicatement le plasma dans un tube EP propre de 1,5 mL (faire attention à ne pas aspirer les cellules), puis centrifuger à 12 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C pour éliminer les cellules résiduelles ou les débris, aspirer délicatement le volume souhaité de surnageant dans un nouveau tube EP, marquer avec un marqueur à base d'huile, stocker dans un réfrigérateur à ultra-basse température à -80°C, éviter les cycles de congélation-dégel répétés, et transporter l'échantillon sur de la glace sèche.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
Services associés
