Séquençage de l'exome entier basé sur un protocole de capture par hybridation

Purification

1. Laissez les billes AMPure XP atteindre la température ambiante pendant au moins 30 minutes.
2. Mélangez bien le réactif sur un mélangeur vortex jusqu'à ce qu'il apparaisse homogène. Ajoutez 180 μl de billes AMPure XP homogènes dans un tube LoBind de 1,5 ml, puis ajoutez la bibliothèque d'ADN fragmentée (~120 μl).
3. Bien mélanger sur un mélangeur à vortex et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Place le tube dans un support magnétique et attendez que la solution devienne claire (3 à 5 minutes).
5. Gardez le tube dans le support magnétique. Jetez la solution clarifiée du tube sans déranger les billes.
6. Continue à maintenir le tube dans le support magnétique pendant que vous dispensez 500 μl d'éthanol à 70 % dans chaque tube.
7. Laissez le tube reposer pendant 1 minute pour permettre aux billes perturbées de se déposer, puis retirez l'éthanol. Répétez cette étape une fois.
8. Séchez les échantillons sur un bloc chauffant à 37°C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que l'éthanol résiduel s'évapore complètement.
Ajoutez 30 μl d'eau sans nucléase, mélangez bien sur un vortex, puis incubez pendant 2 minutes à température ambiante.
10. Placez le tube dans le support magnétique et laissez pendant 2 à 3 minutes ou jusqu'à ce que la solution soit claire.
Retirez environ 30 μl du surnageant dans un tube LoBind frais de 1,5 ml.

Évaluer la qualité

1. Utilisez la puce Agilent DNA 1000 et le kit de réactifs pour préparer la puce avec des échantillons et une échelle.
2. Charge la puce dans le Bioanalyzer 2100 et commence l'analyse dans les 5 minutes suivant la préparation.
3. Vérifiez que l'électrophorogramme montre une distribution avec une taille de pic d'environ 190 nucléotides.

Réparation de fin

1. Préparez le mélange de réaction sur glace. Mélangez bien avec un vortex. Ajoutez 71 μl du mélange de réaction et 29 μl d'échantillon d'ADN à chaque tube. Mélangez en pipetant.
2. Incubez le tube dans un cycler thermique pendant 30 minutes à 20°C. N'utilisez pas le couvercle chauffant.
3. Purifiez l'échantillon en utilisant 90 μl de billes AMPure XP homogènes, en suivant les instructions. Éluez dans 32 μl d'eau sans nucléase.

A-Tailing

1. Préparez le mélange de réaction. Ajoutez 32 μl de chaque échantillon d'ADN dans chaque puits ou tube. Mélangez en pipetant.
2. Incuber dans un cycler thermique pendant 30 minutes à 37°C en veillant à ce que la température du couvercle ne dépasse pas 50°C.
3. Purifiez l'échantillon en utilisant 90 μl de billes AMPure XP homogènes, en suivant les instructions, et éluez dans 15 μl d'eau sans nucléase.
4. Passez immédiatement à l'étape de ligation des adaptateurs.

Ligation d'adaptateur

1. Recuire les adaptateurs.
2. Préparez le mélange de réaction.
Ajoutez 36 μl du mélange de réaction et 14 μl d'échantillon d'ADN dans chaque tube. Mélangez en pipetant.
4. Incubez pendant 15 minutes à 20°C dans un cycler thermique. Ne pas utiliser de couvercle chauffant.
5. Purifiez l'échantillon en utilisant 90 μl de billes AMPure XP homogènes, en suivant les instructions. Éluate dans 52 μl d'eau sans nucléase.

Amplification pré-hybridation

1. Utilisez la moitié des fragments ligaturés avec l'adaptateur pour l'amplification et conservez l'autre moitié à -20°C pour une utilisation future, si nécessaire.
2. Préparez le mélange de réaction (25 μl) comme indiqué dans le Tableau 5 et ajoutez 25 μl de chaque échantillon d'ADN dans chaque tube.
3. Mélangez par pipetage et lancez le programme.
4. Purifiez l'échantillon en utilisant 90 μl de billes AMPure XP homogènes et éluez dans 30 μl d'eau sans nucléase.

Évaluer la qualité et la quantité

1. Utilisez la puce Agilent DNA 1000 et le kit de réactifs pour préparer la puce avec des échantillons et une échelle.
2. Charge la puce dans le Bioanalyseur 2100 et commence l'analyse dans les 5 minutes suivant la préparation.
3. Après la course, déterminez la concentration de l'échantillon par intégration sous le pic.
4. Vérifiez que l'électrophorogramme montre une distribution avec une taille de pic de 250 ± 10 % pb.

Hybridation

Concentrez un aliquote de 500 ng de la bibliothèque à 3,4 μl à l'aide d'un concentrateur sous vide à ≤45 °C.
2. Mélangez les composants pour préparer le mélange de blocs dans un tube PCR.
Ajoutez 3,4 μl de bibliothèque préparée à 147 ng/μl avec 5,6 μl de SureSelect Block Mix (Tube A).
4. Mélangez les composants du Tableau 8 à température ambiante pour préparer le tampon d'hybridation (Tube B).
5. Diluez 1 μl de RNase Block avec 2 μl d'eau sans nucléase.
6. Dans un tube séparé, mélangez 5 μl de la bibliothèque de capture SureSelect avec 2 μl de RNase Block dilué (Tube C).
7. Placez le tube "A" dans le cycler thermique avec le programme suivant.
8. Utilisez un couvercle chauffant sur le cycler thermique à 105°C en permanence.
9. Maintenez le cycler à 65°C pendant que vous ajoutez 40 μl de tampon d'hybridation (Tube B).
Incubez les deux tubes pendant au moins 5 minutes à 65°C.
11. Placez le mélange de la bibliothèque de capture (Tube C) dans le cycler.
12. Incubez les échantillons à 65°C pendant 2 minutes.
13. Maintenez le cycler à 65°C tout en utilisant une pipette pour prélever 13 μl de tampon d'hybridation du tube "B" et ajoutez-le au tube de mélange de la bibliothèque de capture SureSelect "C."
14. Maintenez le cycler à 65°C et transférez tout le contenu du mélange de bibliothèque préparé dans le tube "A" vers la solution d'hybridation dans le tube "C."
15. Scellez soigneusement le tube "C" et incubez le mélange d'hybridation pendant 24 h à 65°C avec un couvercle chauffé.

Préparation des billes magnétiques

1. Conservez le tampon de lavage SureSelect #2 dans un bain-marie à 65°C.
2. Laissez les billes Dynal MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen) atteindre la température ambiante pendant au moins 30 minutes.
3. Resuspendre vigoureusement sur un mélangeur à vortex et prendre 50 μl de billes magnétiques dans un tube microfuge de 1,5 ml.
4. Lavez les perles :
(a) Ajouter 200 μl de tampon de liaison SureSelect.
(b) Mélangez les perles sur un mélangeur vortex pendant 5 s.
(c) Placez le tube dans un support magnétique et attendez que la solution devienne claire (3 à 5 minutes).
(d) Retirez soigneusement et jetez le surnageant.
(e) Répétez les étapes (a à d) pour un total de trois lavages.
5. Resuspendre les billes dans 200 μl de tampon de liaison SureSelect.

Sélection de capture hybride

1. Estimez et enregistrez le volume d'hybridation qui est resté après 24 heures d'incubation.
2. Ajoutez le mélange d'hybridation directement depuis le cycler thermique à la solution de billes, et mélangez en inversant trois à cinq fois.
3. Incubez la solution de capture hybride/billes sur un Nutateur ou équivalent pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Assurez-vous que le contenu se mélange correctement.
5. Tournez brièvement dans une centrifugeuse et séparez les billes et le tampon sur un séparateur magnétique.
6. Gardez le tube dans le support magnétique pendant 3 à 5 minutes.
7. Jetez la solution clarifiée du tube sans perturber les billes.
8. Resuspendre les billes dans 500 μl de tampon de lavage SureSelect #1 en les mélangeant sur un vortex pendant 5 s.
9. Incubez les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante. Mélangez occasionnellement sur un mélangeur vortex.
10. Tourner brièvement dans une centrifugeuse, séparer les billes et le tampon sur un séparateur magnétique, puis éliminer le surnageant.
11. Lavez les perles :
(a) Resuspendre les billes dans 500 μl de tampon de lavage SureSelect #2 préchauffé à 65°C et mélanger sur un vortex pendant 5 s pour resuspendre les billes.
(b) Incubez les échantillons pendant 10 minutes à 65°C dans un bloc chauffant ou équivalent. Mélangez occasionnellement sur un mélangeur vortex.
(c) Faire tourner brièvement dans une centrifugeuse.
(d) Séparez les billes et le tampon sur un séparateur magnétique Dynal et retirez le surnageant.
(e) Répétez les étapes (a à d) pour un total de trois lavages. Enlevez toutes les traces de tampon de lavage avant de passer à l'étape 12.
Mélangez les billes dans 50 μl de tampon d'élution SureSelect sur un mélangeur vortex pendant 5 s pour resuspendre les billes.
13. Incubez les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante. Mélangez occasionnellement sur un mélangeur vortex.
14. Faites tourner brièvement dans une centrifugeuse, puis séparez les billes et le tampon sur un support magnétique.
15. Transférez le surnageant (ADN capturé) dans un nouveau tube microfuge de 1,5 ml.
Ajoutez 50 μl de tampon de neutralisation SureSelect à l'ADN capturé et mélangez brièvement.
17. Purifiez l'échantillon en utilisant 180 μl de billes AMPure XP homogènes selon les instructions et éluez dans 30 μl d'eau sans nucléase.

Amplification post-hybridation

1. Préparez le mélange de réaction sur glace. Mélangez bien avec un vortex.
Ajoutez 15 μl d'échantillon d'ADN à 35 μl du mélange de réaction.
3. Mélangez en pipetant, placez le tube dans un thermocycleur et lancez le programme.
4. Purifiez l'échantillon en utilisant 90 μl de billes AMPure XP homogènes et éluez dans 30 μl d'eau sans nucléase en suivant les instructions.
5. Évaluer la qualité et la quantité.
6. Déterminez la concentration de l'échantillon par intégration sous le pic.
7. L'électrophorogramme devrait montrer un pic dans la plage de taille d'environ 300 à 400 nucléotides.
8. Effectuez une quantification supplémentaire par PCR en temps réel.

Génération de clusters

1. Diluez et dénaturez les bibliothèques à 8 pM (∼1,6 pg/µl d'ADN de 300 pb) en utilisant de la soude caustique à 0,1 N.
2. Décongelez et préparez les réactifs en suivant les instructions du kit de génération de clusters Illumina.
3. Ouvrez et exécutez la recette appropriée sur la station de cluster.
4. Suivez les instructions de la recette pour charger la cellule de flux.
5. Suivez les instructions de la recette pour charger les réactifs.
6. Complétez les étapes de génération de clusters : hybridation, amplification, linéarisation, blocage et hybridation des amorces.
7. Prenez la cellule de flux pour le séquençage.

Séquençage

1. Effectuez une étape de lavage préalable sur le séquenceur.
2. Décongelez et préparez le réactif de séquençage en suivant les instructions du kit de séquençage.
3. Charger le réactif de séquençage.
4. Positions clés sur l'analyseur de génome.
5. Nettoyez et installez le prisme et la cellule de flux.
6. Vérifiez la bonne distribution des réactifs et appliquez de l'huile.
7. Effectuer l'incorporation de la première base de lecture 1 et l'auto-calibration.
8. Vérifiez les indicateurs de qualité.
9. Continuez l'exécution pour le nombre de cycles souhaité.

Référence :

1. Priya R R, Rajasimha H K, Brooks M J, et al. Séquençage de l'exome : capture et séquençage de toutes les régions codantes humaines pour la découverte de gènes liés aux maladies. Développement rétinien : Méthodes et protocoles, 2012 : 335-351.