Affichage de phages et NGS : Comment le séquençage de nouvelle génération améliore les bibliothèques de phages

Affichage de phages sert de technologie fondamentale dans la découverte de médicaments et l'ingénierie des protéines, permettant le criblage de peptides fonctionnels, d'anticorps et de variantes protéiques à travers des répertoires génétiques diversifiés. Cette approche repose sur la construction de bibliothèques avec une diversité de séquences exceptionnelle, dépassant généralement 10^11 variantes uniques.

Les méthodes de dépistage traditionnelles rencontrent des limitations significatives lorsqu'il s'agit de gérer une telle complexité. La composition de la bibliothèque reste opaque, la dynamique d'enrichissement des clones cibles est mal résolue, et les résultats dépendent fortement d'une validation monoclonale laborieuse. Ces contraintes créent des processus de sélection inefficaces et partiellement aveugles.

Séquençage de nouvelle génération (NGS) transforme ce paradigme grâce à un séquençage profond à haut débit et à coût réduit. Sa capacité à scanner rapidement l'espace de séquence a révolutionné les flux de travail d'affichage de phages.

La solution NGS : une plateforme multi-outils

1. Contrôle Total de la Qualité (CTQ) via NGS

• Technologie : Remplace le séquençage Sanger à faible débit par le séquençage massif parallèle (NGS) pour analyser des millions de particules de phages.
• Percée : Réalise un profil global et complet de la composition des bibliothèques, dépassant de loin l'échelle des méthodes traditionnelles.
• Évaluations de la qualité fondamentale :
  • Diversité fonctionnelle : Quantifie le nombre de clones effectifs réels.
  • Couverture de conception : Évalue si toutes les combinaisons de mutations conçues sont adéquatement représentées.
  • Diagnostic des préférences système : Identifie les biais liés à la construction (par exemple, ligature inefficace, perte de séquence, déplétion de séquence toxique).
• Intégrité du cadre de lecture : Assure des cadres de lecture ouverts corrects sans codons d'arrêt.
• Avantage : Permet une détection précoce des bibliothèques défectueuses, guidant l'optimisation des paramètres et des stratégies pour améliorer la fonctionnalité et la représentativité, tout en préservant les ressources.

2. Suivi en temps réel du processus de dépistage

• Transformation : Convertit le dépistage traditionnel en "boîte noire" en un processus dynamiquement traçable et observable.
• Méthode : Implique un séquençage profond de la bibliothèque avant et après chaque étape (liaison, lavage, élution, amplification) pour fournir un aperçu au niveau moléculaire.
• Capacités :
  • Suites les changements de fréquence des clones individuels au cours des rondes de dépistage.
  • Identifie directement les séquences enrichies ou appauvries par la pression de sélection.
  • Découvre des résidus, des domaines ou des motifs de liaison conservés grâce à un alignement multi-tours.
• Fonction de diagnostic : Les données servent d'outil de diagnostic (par exemple, les plateaux d'enrichissement suggèrent des conditions trop strictes ; la perte de diversité indique un biais d'amplification).
• Avantage : Permet des ajustements en temps réel, basés sur les données, de la stratégie de dépistage (par exemple, optimisation de la rigueur, ajustement des entrées) pour améliorer considérablement l'efficacité et les taux de réussite.

3. Découverte directe de molécules candidates

• Chronométrage : Lors des tours de sélection ultérieurs (généralement 2 à 4), les données NGS révèlent clairement les clones les plus enrichis et les familles de séquences dominantes.
• Gain d'efficacité : Contourne complètement les étapes traditionnelles chronophages de sélection aléatoire, de culture et de séquençage Sanger de centaines de clones.
• Flux de travail :
  • Sélectionnez les meilleures séquences candidates en fonction du classement d'enrichissement NGS et des données d'intégrité.
  • Synthétiser des oligonucléotides pour une expression rapide de protéines recombinantes.
  • Validez rapidement les candidats en utilisant des techniques à haut débit (par exemple, ELISA, SPR, essais fonctionnels).
• Avantage principal : Réduit considérablement le délai entre la fin du dépistage et l'acquisition de molécules validées, économisant ainsi des semaines, voire des mois, de temps de R&D.

D'autres méthodes de séquençage NGS de phages sont disponibles en référence, "Séquençage de Nouvelle Génération pour l'Analyse des Phages : Une Approche Moderne".

La compréhension du rôle des données NGS dans le contrôle de la qualité des bibliothèques de phages peut être référencée dans "Contrôle de la qualité des bibliothèques de phages avec des données NGS".

Études de cas : NGS en action

Étude de cas 1 : Dompter le biais d'amplification

• Surveillance dynamique du biais d'amplification : Une analyse NGS quantitative a révélé un changement substantiel de la distribution des clones après amplification, caractérisé par une augmentation nette de la représentation du type sauvage (passant de 10,36 % à 90,37 % dans SA1 et de 5,99 % à 61,81 % dans SA2). Parallèlement, une réduction drastique des clones uniques a été observée (par exemple, dans SA2, passant de 96,66 % à 24,6 %), démontrant que le processus d'amplification induit une homogénéisation significative de la bibliothèque.
• Identification des motifs fonctionnels : L'analyse utilisant le facteur d'enrichissement (EF-RRB) a permis de cibler des clones à haute efficacité, tels que les variantes Pr-TUP (par exemple, dans SA2, EF > 126 000). Cette approche a permis de suivre les motifs associés à l'amplification (par exemple, May/Ramay, avec des scores d'enrichissement allant jusqu'à 142 fois), tout en excluant simultanément les motifs non fonctionnels liés aux β-turn, qui n'ont montré aucun enrichissement (tous les ES < 1) indépendamment de l'efficacité d'amplification.
• Profilage spatiotemporel des acides aminés : L'analyse a révélé des dynamiques positionnelles distinctes, telles qu'une augmentation de 3,7 fois de la fréquence de l'arginine C-terminale après amplification dans SA1 et une diminution de 82 % de la leucine N-terminale dans SA2. De plus, des variations spécifiques aux lots ont été identifiées, y compris une surexpression de L-Phénylalanine dans SA1 et un enrichissement prononcé en tyrosine dans SA2.
• Directives pour l'optimisation de la bibliothèque : La distribution de l'EF a indiqué que SA1 contenait 3,2 fois plus de clones hyper-prolifératifs (EF > 10²) que SA2, soulignant la nécessité de limiter le nombre de cycles d'amplification pour éviter les biais. De plus, il a été conseillé de maintenir la teneur en L-Cystéine en dessous de 1 % afin d'éviter toute interférence potentielle médiée par des liaisons disulfure (Sinkjaer A.W. et al., 2025).

Graphiques à barres empilées visualisant la distribution de fréquence des séquences observées dans les données NGS des expériences SA1 et SA2 (Sinkjaer A.W. et al., 2025)

Étude de cas 2 : Explorer la boîte à outils cachée de la nature

• Profilage fonctionnel communautaire à haut débit : Grâce au traitement de 691 206 lectures NGS (comprenant 153 002 séquences non redondantes), une caractérisation complète du métasécretome microbien du rumen a été réalisée. Cette analyse a identifié 196 familles de CAZymes, y compris un enrichissement de 14,3 fois des cellulases GH124, faisant avancer de manière significative l'étude des sécrétomes du rumen au-delà des limites des méthodologies conventionnelles. La validation de l'enrichissement fonctionnel subséquent a confirmé le ciblage efficace des hydrolases extracellulaires (par exemple, les estérases CE1/CE3). Notamment, les fonctions associées au transport et au métabolisme des glucides constituaient 19,4 % de l'ensemble de données, dépassant la ligne de base métagénomique (10,6 %) de 83 %.
• Suivi de l'efficacité du criblage : Le processus a montré une grande sélectivité, entraînant un enrichissement 29 fois supérieur des clones sécrétoires. L'efficacité de la présentation de fusion PIII a atteint 94,4 %, dépassant significativement l'attente théorique de 3,3 %. De plus, le système a réussi à identifier et à éliminer 5,6 % des clones non sécrétoires (par exemple, des peptides courts et des protéines intracellulaires), conservant ainsi des ressources qui auraient été dépensées pour leur validation fonctionnelle.
• Optimisation dirigée de la bibliothèque : Les efforts d'optimisation se sont concentrés sur la sélection des peptides signal, en excluant spécifiquement les voies de type II/TAT en raison de leur incompatibilité avec le repliement périplasmique d'E. coli. Les peptides signal de type I ont donc été prioritaires. L'analyse de la compatibilité de l'hôte a révélé une dominance des séquences bactériennes Gram-négatives (par exemple, 29 % de Bacteroidetes), attribuée à leur meilleure adaptation à la machinerie de traitement des peptides signal de l'hôte (Ciric M et al., 2014).

Aperçu de la construction et de la sélection de la bibliothèque de métasécrétomes (Ciric M et al., 2014)

L'avenir : Conception de bibliothèques intelligentes alimentée par le NGS

Le NGS transcende la simple optimisation du dépistage, émergeant comme un catalyseur pour une architecture de bibliothèque innovante :

• Ingénierie de bibliothèque informée par les données : L'intégration des ensembles de données NGS historiques permet la construction de vastes bases de données de séquences fonctionnelles. Ces dépôts éclairent les relations critiques entre séquence, structure et fonction, y compris les effets des mutations combinatoires, les régions susceptibles de plasticité structurelle et les motifs de liaison récurrents. Des modèles d'apprentissage automatique, tels que les réseaux de neurones et les modèles de Markov cachés, peuvent être entraînés sur ces données pour prévoir l'impact des mutations ponctuelles et combinatoires sur l'affinité et la spécificité de liaison. Cette capacité prédictive guide l'optimisation des stratégies de mutagenèse—informant la sélection des sites, des types de mutations et des fréquences—et facilite même la conception de novo de protéines, illustrée par le développement de structures d'anticorps humanisées stables. Par conséquent, cette approche élève la conception de bibliothèques d'un processus empirique à une stratégie rationnelle et guidée par les données, améliorant considérablement la qualité de la bibliothèque initiale et l'efficacité des découvertes ultérieures.
• Construction de bibliothèques synthétiques et contrôle de qualité : Avec la baisse des coûts de synthèse de l'ADN, les bibliothèques entièrement synthétiques (par exemple, les répertoires d'anticorps humanisés et les bibliothèques de domaines de liaison sur mesure) gagnent en importance en raison de leur flexibilité de conception et de leur capacité à contourner les séquences immunogènes. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) sert de norme définitive d'assurance qualité pour ces bibliothèques, fournissant une vérification à grande échelle de l'exactitude de la synthèse des pools d'oligonucléotides en détectant les erreurs (délétions, insertions, erreurs d'appariement). Il quantifie également la diversité post-amplification pour confirmer le respect des spécifications de conception et identifie les biais introduits lors des workflows de synthèse ou de clonage. Ce contrôle de qualité rigoureux est primordial, garantissant que les bibliothèques synthétiques coûteuses répondent aux seuils de qualité et de représentativité avant d'engager des ressources dans un criblage fonctionnel.

Étude de cas 1 : Concevoir de meilleurs anticorps depuis le début

Assurance de qualité des bibliothèques synthétiques

Le NGS permet la validation en boucle fermée des bibliothèques synthétiques en scannant des millions de clones. Ce processus confirme la fidélité des codons (par exemple, en vérifiant un rapport Ser/Tyr conçu de 1:1 à la position 117 du CDR3), garantit l'intégrité du cadre de lecture grâce à la détection de mutations de décalage et de contamination par des codons d'arrêt, et fournit une quantification précise de la diversité—mesurant avec précision 1,75×10⁸ clones uniques, un chiffre qui dépasse les estimations traditionnelles basées sur l'efficacité de transformation.

Modélisation de la relation structure-activité

Une analyse conformationnelle de NanoNet a été réalisée sur 10 000 séquences de nanobodies validées par NGS. Les simulations ont révélé que les boucles CDR3 de 14 acides aminés adoptent une conformation courbée exclusive, démontrant une divergence structurelle claire par rapport à la topologie étendue observée dans les boucles plus courtes de 10 acides aminés. Cette information structurelle indique qu'une longueur de CDR3 étendue améliore l'adéquation moléculaire pour interagir avec des surfaces de liaison concaves.

Stratégies d'optimisation de la stabilité

Pour améliorer la stabilité, les données NGS ont guidé l'élimination des clusters hydrophobes exposés en surface afin de réduire la propension à l'agrégation. De plus, l'ingénierie polaire a été utilisée pour introduire stratégiquement des résidus hydrophiles (par exemple, en atteignant plus de 80 % de contenu en acides aminés polaires à des sites spécifiques comme CDR1-Asn31), améliorant ainsi la solubilité et l'intégrité structurelle de la protéine.

Avancées révolutionnaires

Cette recherche a transformé la conception des bibliothèques, passant d'approches empiriques à une stratégie rationnelle guidée par des structures de PDB de plus de 600 nanobodies. Une percée clé est le dépassement des contraintes immunitaires naturelles, car les bibliothèques synthétiques permettent des longueurs de CDR3 dépassant 24 acides aminés. Les cadres stabilisés qui en résultent permettent de cibler des interactions protéine-protéine intracellulaires auparavant considérées comme inaccessibles, tandis que l'architecture en modèle permet une itération rapide des variantes de longueur de CDR, ouvrant de nouvelles voies pour le développement thérapeutique (Moreno E et al., 2022).

Fréquences des acides aminés par position randomisée pour la bibliothèque construite (Moreno E et al., 2022)

Défis et orientations futures

Malgré la transformation induite par le séquençage de nouvelle génération, des limitations clés persistent :

Contraintes techniques

• Biais d'amplification :
  • La PCR lors de la préparation de la bibliothèque distord la représentation de la fréquence des séquences. Les stratégies d'atténuation incluent :
    • Polymérases à haute fidélité ;
    • Numéros de cycle optimisés ;
    • Codes moléculaires.
• Limitations de longueur de lecture : Les plateformes à courtes lectures (par exemple, Illumina) nécessitent un assemblage des lectures pour de grands inserts (par exemple, des fragments scFv), ce qui peut compromettre l'exactitude dans les régions variables complexes. Bien que les technologies à longues lectures (PacBio, Oxford Nanopore) offrent des solutions, l'équilibre entre coût, débit et précision reste un défi.

Exigences computationnelles

• Complexité du traitement des données :
  • La gestion de vastes ensembles de données NGS nécessite des pipelines bioinformatiques sophistiqués pour :
    • Contrôle de qualité et dé-duplication ;
    • Assemblage/annotation de séquences ;
    • Alignement, analyse de fréquence et enrichissement différentiel ;
    • Découverte de motifs

Cela crée des exigences significatives en matière de ressources informatiques et d'expertise.

Considérations économiques

• Équilibre Coût-Bénéfice : Malgré la baisse des coûts de séquençage, le séquençage approfondi de grandes bibliothèques—particulièrement à travers plusieurs rondes de dépistage—engendre des dépenses substantielles. L'allocation stratégique des ressources doit s'aligner sur l'envergure du projet et les contraintes budgétaires.

Conclusion : Le microscope indispensable

NGS a fondamentalement transformé la technologie de phage display, offrant une compréhension moléculaire sans précédent, un contrôle des processus et une efficacité de dépistage. En installant un "microscope moléculaire à haute résolution" tout au long des workflows de construction de bibliothèques et de biopanning, NGS convertit des processus traditionnellement opaques en systèmes analyzables quantitativement et dynamiquement optimisables.

• Les avancées clés qui ont été rendues possibles incluent :
  • Caractérisation complète de la bibliothèque ;
  • Surveillance de panoramique en temps réel ;
  • Identification précise des clones de haute valeur ;
  • Conception de bibliothèque intelligente basée sur les données ;
  • Contrôle de qualité rigoureux des bibliothèques synthétiques.

Ces capacités accélèrent la découverte de molécules ciblées (anticorps, ligands) tout en augmentant les taux de réussite. Au-delà de l'optimisation, le séquençage de nouvelle génération (NGS) élargit le front d'innovation de la technologie, comme le montre notre mise en œuvre de bibliothèques hybrides à coût réduit.

Trajectoire future

• La synergie du display phagique NGS continuera à propulser des percées dans :
  • Développement d'anticorps thérapeutiques ;
  • Ingénierie des protéines de précision ;
  • Conception avancée de biosenseurs ;
  • Études fondamentales des interactions moléculaires.

Dans l'exploration des paysages fonctionnels des protéines, le séquençage de nouvelle génération (NGS) émerge comme un outil indispensable, permettant aux scientifiques de récupérer des joyaux fonctionnels des océans moléculaires avec une précision et une efficacité sans précédent.

Pour une approche plus détaillée du séquençage des phages, veuillez vous référer à "Séquençage du génome des phages : méthodes, défis et applications.

Pour en savoir plus sur le séquençage du phage M13, voir "Séquençage du génome du phage M13 : des bibliothèques d'affichage à l'analyse des données.

Les gens demandent aussi

Quels sont les avantages de l'affichage de phages ?

L'un de ses principaux atouts est le criblage à haut débit, permettant aux chercheurs d'identifier rapidement des agents de liaison aux antigènes cibles lors d'une seule expérience.

Comment fonctionnent les bibliothèques de phages à affichage ?

La bibliothèque de phages par affichage est incubée avec une molécule cible immobilisée sur un support solide. Les phages spécifiques de la bibliothèque se lient à la molécule et les phages non liés sont éliminés par lavage. Les phages spécifiques sont ensuite éludés et amplifiés dans des bactéries.

Qu'est-ce que l'affichage de phages et pourquoi était-il utile pour l'évolution dirigée ?

Évolution dirigée par affichage de phages | LIPhy - Université ...

L'affichage de phages est une technique d'évolution dirigée utilisée pour sélectionner et optimiser des protéines (fragments d'anticorps) ou des peptides avec des propriétés souhaitées.

Quel est le principe de l'affichage de phages ?

Affichage de phages - Wikipédia

Dans cette technique, un gène codant pour une protéine d'intérêt est inséré dans un gène de protéine de coque de phage, ce qui amène le phage à "afficher" la protéine à l'extérieur tout en contenant le gène de la protéine à l'intérieur, résultant en une connexion entre le génotype et le phénotype.

Quelle est la différence entre l'affichage de phages et l'affichage de ribosomes ?

Affichage de phages – utilise des bactériophages pour présenter des peptides/protéines à leur surface. Affichage par ribosome – système sans cellules maintenant un complexe d'ARNm, de ribosome et de protéine naissante.

Références :

1. Noh J, Kim O, Jung Y, Han H, Kim JE, Kim S, Lee S, Park J, Jung RH, Kim SI, Park J, Han J, Lee H, Yoo DK, Lee AC, Kwon E, Ryu T, Chung J, Kwon S. Récupération à haut débit de l'ADN physique pour des clones identifiables par NGS dans une bibliothèque d'affichage de phages. AcMabs. avril 2019 ; 11(3) : 532-545.
2. Sinkjaer AW, Sloth AB, Andersen AO, Jensen M, Bakhshinejad B, Kjaer A. Une analyse comparative de la composition des séquences dans différents lots d'une bibliothèque de peptides par affichage phagique pendant l'amplification.. Virol J1 févr. 2025 ; 22(1) : 24.
3. Ciric M, Moon CD, Leahy SC, Creevey CJ, Altermann E, Attwood GT, Rakonjac J, Gagic D. Approche d'affichage de phages sélectifs du métasécretome pour explorer le potentiel fonctionnel d'une communauté microbienne du rumen. BMC Genomics2014 12 mai ; 15(1) : 356.
4. Moreno E, Valdés-Tresanco MS, Molina-Zapata A, Sánchez-Ramos O. Conception et construction d'une bibliothèque de nan anticorps par affichage phagique basée sur la structure. BMC Res Notes. 29 mars 2022 ; 15(1) : 124.
5. Pashova S, Schneider C, von Gunten S, Pashov A. Profilage du répertoire d'anticorps avec des matrices de mimotopes. Hum Vaccin Immunother. Févr 2017 ; 13(2) : 314-322.
6. Vekris A, Pilalis E, Chatziioannou A, Petry KG. Un pipeline computationnel pour l'extraction d'informations biologiques exploitables à partir d'expériences de phage display NGS. Frontiers in Physiology2019 Sep 24;10:1160.