Séquençage du génome des phages : Méthodes, défis et applications

Séquençage du génome de phage se présente comme une méthodologie essentielle dans le domaine de la microbiologie et de la biotechnologie, permettant une exploration détaillée de l'architecture génétique des bactériophages. Le déchiffrement de ces génomes viraux est fondamental pour diverses applications, allant des innovations thérapeutiques à l'amélioration de notre compréhension des dynamiques des écosystèmes microbiens. Cet article examine les techniques de séquençage utilisées, les défis de recherche associés et les applications motrices qui propulsent ce domaine en avant.

Propriétés génomiques distinctives et importance de la recherche sur les bactériophages

En tant qu'entités biologiques les plus abondantes de la Terre, avec plus de 1 031 espèces caractérisées, les bactériophages présentent des architectures génomiques uniques qui les distinguent de leurs homologues bactériens :

• Compacité extrême : Le chevauchement des gènes atteint une densité de 20 à 30 %, avec des éléments génétiques imbriqués où les séquences codantes se trouvent à l'intérieur d'autres gènes.
• Plasticité structurelle : Les répétitions terminales (par exemple, les sites COS ou les DTR) permettent des mécanismes dynamiques d'emballage et de recombinaison du génome.
• Adaptation du mode de vie : Les phages virulents (lytiques) possèdent des génomes épurés dépourvus de machinerie d'intégration, tandis que les variantes tempérées (lysogéniques) portent des gènes d'intégrase mais omett généralement les modules de lyse.

Imperatifs de recherche : L'analyse du génome des phages sous-tend une compréhension critique des interactions hôtes, des trajectoires évolutives et du développement thérapeutique. Les phages lysogènes médiatisent environ 80 % du transfert horizontal de gènes de résistance aux antibiotiques, tandis que les variantes lytiques montrent un potentiel exceptionnel en tant qu'armes de précision contre les pathogènes résistants aux médicaments. Ces caractéristiques génomiques distinctives permettent directement des solutions centrées sur les phages aux crises de résistance antimicrobienne.

Le flux de travail de séquençage des phages : de la préparation de l'échantillon à l'analyse des données

À mesure que la recherche sur les phages progresse, des flux de travail de séquençage optimisés—englobant la préparation des échantillons, le choix de la plateforme et la bioinformatique—sont devenus essentiels. Cette section détaille les stratégies et technologies clés tout au long du pipeline de séquençage.

Techniques critiques de préparation d'échantillons

Le traitement d'échantillons de haute qualité garantit le succès du séquençage, en particulier pour des matrices complexes. Les optimisations essentielles comprennent :

Concentration et Purification

• Échantillons liquides (par exemple, eau) : L'ultrafiltration concentre les phages, améliorant la sensibilité de détection.
• Matrices complexes (par exemple, sol/eaux usées) : Combiner la filtration par flux tangentiel (TFF) avec des techniques émergentes de séparation magnétique pour maximiser la pureté tout en minimisant la contamination par l'hôte.

Extraction d'acides nucléiques

• La filtration sur membrane en gel de silice élimine les sels et les inhibiteurs des extraits d'ADN/ARN.
• Les études sur les phages à ARN nécessitent une transcription inverse immédiate pour préserver l'intégrité.

Décontamination de l'hôte

• Les échantillons cliniques nécessitent un traitement enzymatique (DNase I/RNase A + Protéinase K ; 37°C/1h) pour dégrader les acides nucléiques et les protéines de l'hôte.
• La filtration séquentielle de 0,45 μm à 0,22 μm élimine les débris bactériens.
• La sélection négative par billes magnétiques (billes recouvertes d'anticorps) permet d'atteindre plus de 95 % d'élimination des bactéries dans les échantillons de crachats.

Méthodologies d'enrichissement

Extraction d'acides nucléiques

Diagramme de flux du processus d'extraction séparée (Tang X et al., 2023)

(2) Sélection de la plateforme de séquençage

L'alignement stratégique de la plateforme avec les objectifs de recherche garantit une qualité de données optimale :

Optimisation Spéciale des Échantillons

• Échantillons métagénomiques (ADN viral <0,1 %) : Mettre en œuvre WGA ou LASL (ligature d'adaptateurs pour ssDNA)
• Phages lysogènes : Induire avec 0,5 μg/mL de mitomycine C avant le séquençage.

(3) Analyse bioinformatique Pipeline

Contrôle de qualité et décontamination

• FASTQC : Évalue la qualité des lectures et le contenu en GC.
• Trimmomatic : Supprime les séquences d'adaptateurs et les bases de faible qualité.
• Bowtie2/BWA : Filtre les génomes hôtes résiduels.

Assemblage et Polissage du Génome

• Lectures courtes : SPAdes génère des assemblages préliminaires.
• Lectures longues : Canu/Flye résolvent les répétitions.
• Phageterm : Valide les répétitions terminales pour la circularisation.

Annotation génétique

• Structurale : Prodigal/GeneMark prédit les ORFs ; tRNAscan-SE détecte les gènes tRNA.
• Fonctionnel : pVOGs et InterProScan annotent les domaines ; KEGG/GO classifient les voies.
• ARN non codants : Infernal identifie des éléments régulateurs (par exemple, crARN).

Génomique comparative

• VIRIDIC/VCONTACT2 : Classifiez les phages via des réseaux de similarité de nucléotides/protéines.
• FastTree/RAxML : Reconstituer les relations évolutives.

(4) Visualisation et interprétation des données

• Cartographie du génome :
  • CIRCOS : Illustre les caractéristiques structurelles et les régions synteniques.
  • IGV : Visualisation multiplateforme des données d'alignement.
• Analyse fonctionnelle du réseau :
  • Cytoscape : Cartographie des interactions géniques pour élucider les modules fonctionnels et les mécanismes d'adaptation des hôtes.

Pour voir comment la plateforme Illumina peut séquencer en profondeur des bibliothèques de phages, voir "Séquençage profond de bibliothèques de phages utilisant des plateformes Illumina.

Défis majeurs et percées technologiques dans la recherche sur les phages

Défi I : Détection des phages lysogènes - Les "Assassins furtifs"

Nature du défi

Les phages lysogéniques échappent à la détection en s'intégrant en tant que prophages dans les chromosomes hôtes. Les méthodes de culture traditionnelles détectent moins de 1 % des phages libres en raison de :

• Intégration occulte : Les prophages restent latents dans les génomes hôtes.
• Limitations des biomarqueurs : Seuls 60 % portent des gènes d'intégrase (int), tandis que les sites attP/attB présentent une grande variabilité de séquence.
• Risques écologiques : Les prophages abritent fréquemment des gènes de résistance aux antibiotiques (par exemple, SUL1 dans le sol) ou des facteurs de virulence, accélérant la propagation pathogène par transfert horizontal de gènes.

Solutions révolutionnaires

Défi II : Annotation ORFan - "Matière Sombre Fonctionnelle"

Causes profondes

• Fraction inconnue élevée : 40-50 % des gènes de crAssphage n'ont pas d'homologues ; les bases de données traditionnelles (pVOGs/InterProScan) atteignent une sensibilité d'annotation <20 %.
• Origines complexes : Le transfert horizontal de gènes, le surimpression génétique et la domestication des transposons stimulent l'unicité des séquences.

Solutions multidimensionnelles

Défi III : Assemblage de séquences répétitives - "Puzzles génomiques"

Goulots d'étranglement techniques

• Régions à répétition élevée : répétitions terminales (sites cos) et tandems de capsides (15-50 kb) fragmentent les assemblages Illumina (par exemple, phage de Vibrio harveyi : 21 contigs initiaux).
• Erreurs algorithmiques : Les assembleurs interprètent mal les répétitions comme des régions hétérozygotes (par exemple, mauvaise assemblage par SPAdes).

Approches innovantes

Défi IV : Barrières des échantillons de sol/de microbiote intestinal

Phages du sol : adsorption et faible abondance

• Phages intestinaux : goulets d'étranglement de l'association hôte
• Culture d'hôtes : >80 % des bactéries intestinales nécessitent des milieux personnalisés (par exemple, hème/vitamine K1) ; <1 % de culturabilité.
• Phages sans plaque : >60 % indétectables par essai de plaque → FACS + séquençage de cellules uniques (par exemple, crAssphage).
• Prédiction de l'hôte :
  • PhiML : 50-70 % de précision → amélioré par le couplage des espaces CRISPR
  • Co-occurrence métagénomique : Analyse simultanée du virome et des bactéries

Scénarios d'application : de la recherche fondamentale à la transformation industrielle

Contrôle biologique

Cette étude a isolé un nouveau bactériophage à longue queue vB (famille des Siphoviridae) ciblant spécifiquement Xanthomonas oryzae (Xoo), l'agent responsable de la brûlure bactérienne des feuilles de riz. Le phage a montré une spécificité stricte, lyse uniquement Xoo sans affecter d'autres espèces bactériennes non liées.

Efficacité biocontrôle significative : In vitro, le traitement par phage a atteint une réduction de 99,95 % des cellules viables de Xoo en 48 heures. Il est important de noter qu'une seule application en champ de la formulation de phage pur a permis une suppression de la maladie de 90,23 % sur une période de 7 jours. Cependant, l'efficacité a été considérablement diminuée lorsque du lait écrémé a été incorporé dans la formulation. Ces résultats démontrent collectivement le fort potentiel du phage vB en tant qu'agent de biocontrôle pour la gestion durable sur le plan environnemental de la brûlure bactérienne des feuilles de riz (Jain L et al., 2023).

Applications cliniques de la thérapie par phages

Intervention pour pancréatite nécrosante

Un patient atteint d'une infection à Acinetobacter baumannii multirésistant a été libéré avec succès après 245 jours d'hospitalisation, ayant reçu le premier cocktail de phages intraveineux approuvé par la FDA pour la pancréatite nécrosante.

2. Pénétration démontrée de la BHE

Dans un cas d'encéphalite post-craniotomie, l'administration intraveineuse de phages a réussi à supprimer la prolifération bactérienne au sein du système nerveux central malgré une durée de traitement abrégée. Ce résultat fournit des preuves cliniques du transit des phages à travers la barrière hémato-encéphalique.

3. Gestion de la co-infection par le COVID-19

Parmi quatre patients atteints de COVID-19 sévère présentant des infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes (CRAB), deux ont pu bénéficier d'une sortie et d'une réhabilitation grâce à une thérapie par phages intraveineuse en usage compassionnel (Li Y et al., 2023).

Lutte contre la résistance bactérienne

Le phage VB/F14 démontre un potentiel significatif dans la lutte contre Klebsiella pneumoniae résistant aux carbapénèmes (CRKP) grâce à un mécanisme d'action triple synergique :

• Lyse ciblée des hôtes : Le phage présente une activité précise contre les clones épidémiques de CRKP largement répandus dans le monde (ST11, ST14, ST15) et le sérotype capsulaire KL24. L'infection est très productive, caractérisée par une courte période de latence (20-30 minutes) et une grande taille de décharge, libérant une quantité substantielle de progéniture virale par cellule infectée (F13 : 56 PFU ; F14 : 87 PFU).
• Disruption des biofilms : VB/F14 combat efficacement les biofilms par des mécanismes dépendants de la concentration. À des concentrations plus élevées, il inhibe directement la formation de biofilms. Des concentrations plus faibles permettent à son activité dépolymérase de démanteler les structures de biofilms existantes, libérant les bactéries intégrées dans un état planctonique vulnérable et augmentant leur susceptibilité à la pénétration des antibiotiques.
• Délai de résistance : L'utilisation d'un cocktail de phages double (F13 + F14) entrave considérablement l'émergence de mutants CRKP résistants. Cette combinaison retarde la réapparition bactérienne détectable de 7 à 10 heures par rapport aux traitements à phage unique, réduisant ainsi de manière substantielle le risque de résistance résultant de mutations ponctuelles (Senhaji-Kacha A et al., 2024).

Suivi des populations bactériennes

Les bactériophages fonctionnent comme des capteurs environnementaux critiques et des régulateurs au sein des écosystèmes du sol. Cette étude inaugure l'application de la technologie HI-C pour capturer in situ les dynamiques phage-hôte, révélant des mécanismes d'adaptation clés :

• Changement de survie induit par le stress : Sous stress de sécheresse, les phages montrent une conversion prononcée de leur stratégie de survie des cycles lytique aux cycles lysogéniques, augmentant les taux de lysogénie de 70 %. Cela implique l'inactivation des virions libres et une dormance intégrée à l'hôte, préservant ainsi la viabilité de la population.
• Coevolution dirigée par l'hôte : Les phages infectent de manière préférentielle les actinobactéries tolérantes à la sécheresse. Cette stratégie de "passager clandestin" exploite les adaptations de l'hôte, renforçant la résilience des phages face aux stress environnementaux.
• Modulation du réseau écologique : La lyse médiée par les phages de la flore microbienne centrale (taux de lyse de 45 %) déclenche un shunt viral, libérant des nutriments qui restructurent la composition de la communauté et son potentiel fonctionnel.
• Prolifération des phages généralistes : Après la sécheresse, des phages à large éventail d'hôtes (identifiés empiriquement dans 15 classes bactériennes) montrent un avantage compétitif, augmentant en abondance relative de 30 %. Cette infectivité à large spectre facilite une adaptation rapide aux niches (Wu R et al., 2023).

Interactions phage-hôte dans le sol révélées par la métagénomique Hi-C (Wu R et al., 2023)

Transmission médiée des gènes de résistance aux antibiotiques (ARGs)

Les pratiques agricoles influencent de manière significative le réservoir et la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques (ARGs) dans le sol, la transduction médiée par les phages représentant une voie critique. Les principales conclusions révèlent :

Les impacts de l'application de fumier varient selon la fraction.

• Fraction bactérienne : La fertilisation avec du fumier de vache brut ou des biosolides a considérablement augmenté l'abondance des ARG bactériens (par exemple, strA, SUL1). Cependant, le prétraitement du fumier par compostage a considérablement atténué cet effet d'enrichissement.
• Fraction de phages : En revanche, les niveaux d'ARG associés aux phages sont restés inchangés en fonction du type de fertilisation, indiquant leur indépendance par rapport aux apports exogènes à court terme.

Les antibiotiques subcliniques déclenchent une transduction sélective.

• L'exposition au céfoxitine à 1/10 de sa concentration de seuil clinique a induit une transduction médiée par des bactériophages, entraînant une augmentation quadruple de la résistance des coliformes du sol.
• L'ampicilline, à un niveau sub-inhibiteur comparable, n'a pas réussi à induire la transduction. Cet effet différentiel peut découler de variations dans l'expression des gènes de β-lactamase nécessaires à la transduction.

Preuves soutenant le mécanisme de transduction

• L'analyse quantitative a révélé que l'abondance du gène rrnS associé aux phages était inférieure de huit ordres de grandeur à celle de son homologue bactérien, démontrant la rareté des événements de transduction (environ 1 sur 10⁸ infections).
• Les préparations de phages purifiés ont confirmé l'absence de contamination par l'ADN bactérien. Il est crucial de noter que l'augmentation de la résistance ne s'est produite que lorsque des bactéries viables coexistaient avec des phages, confirmant que la transduction dépend d'une infection active (Ross J et al., 2015).

Orientations futures et plateformes de ressources

Tendances technologiques convergentes

• Synergie CRISPR-Phage : Utilisation de systèmes basés sur CRISPR pour éditer précisément les génomes des phages, améliorant leur spécificité de ciblage et leur potentiel thérapeutique (par exemple, démontré par la modification de phages Aeromonas).
• Multiomique à cellule unique : Application d'approches intégrées, telles que la technologie de puce microfluidique, pour capturer simultanément les réponses transcriptomiques de l'hôte et surveiller en temps réel la dynamique d'infection par les phages au sein de cellules bactériennes individuelles.

Plateformes de ressources clés pour la recherche sur les phages

PHANOTATE

• Type : Outil de prédiction génique (basé sur un algorithme)
• Fonction principale : Spécialisée dans l'annotation des génomes de phages. Utilise un algorithme unique de théorie des graphes pour identifier les chemins optimaux de cadres de lecture ouverts (ORF) à travers les six cadres de lecture de l'ADN. Son principe sous-jacent suppose que les régions non codantes désavantagent la survie des phages, pénalisant les régions intergéniques et les chevauchements de gènes.
• Caractéristiques principales : Accepte les séquences de génomes de phages (FASTA) ; produit des séquences codantes de protéines prédites (CDS) dans plusieurs formats (GenBank, GFF, GFF3, FASTA, FAA).
• Portée : Annotation génomique spécifique aux phages.

Base de données des actinobactériophages / PhagesDB

• Type : Base de données de curation spécialisée
• Fonction principale : Répertoire centralisé pour collecter, organiser et diffuser des données sur les phages infectant les Actinobactéries. Intègre des données mondiales sur les séquences génomiques, les hôtes d'isolement, les morphologies et la taxonomie, avec des contributions significatives de laboratoires académiques.
• Fonctionnalités clés : Permet la navigation dans le génome des phages, la recherche, le téléchargement (séquences/annotations), l'analyse comparative et l'accès à des ressources éducatives.
• Portée : Exclusivement les Actinobactériophages.

IMG/VR (Génomes Microbiens Intégrés et Viromes)

• Type : Plateforme Génomique Complète
• Fonction principale : Plateforme d'intégration à grande échelle (maintenue par le DOE JGI) présentant le sous-système IMG/VR dédié au stockage, à l'analyse et à la comparaison des génomes viraux (y compris des phages). Agrège des séquences provenant de sources publiques, d'assemblages métagénomiques et de projets JGI.
• Fonctionnalités clés : Offre une recherche puissante, une génomique comparative (annotation, classification fonctionnelle, phylogénie), des outils de visualisation et prend en charge le téléchargement/analyse de données utilisateur.
• Champ : Tous les virus, y compris les bactériophages.

Conclusion

La génomique des phages a évolué d'une technique isolée à un domaine multidisciplinaire intégrant l'expérimentation en laboratoire, la bioinformatique et l'intelligence artificielle. La chute des coûts de séquençage à longues lectures (par exemple, PacBio Revio projeté à environ 1 000 $ par génome d'ici 2025) et l'avènement d'outils analytiques dédiés accélèrent la découverte de la "matière noire" virale. Les progrès futurs nécessitent des percées dans les protocoles de préparation d'échantillons standardisés, l'analyse intégrée des ensembles de données cross-omics et la validation fonctionnelle robuste des gènes de phages. Atteindre ces jalons est essentiel pour réaliser l'application complète des ressources phagiques dans le cadre intégré de la "One Health".

Pour plus d'informations sur ce qu'est le séquençage de phages, voir "Qu'est-ce que le séquençage de phages ? Un guide complet pour les chercheurs.

Référence :

1. Podlacha M, Węgrzyn G, Węgrzyn A. "Bactériophages - Virus dangereux agissant incognito ou sauveurs sous-estimés dans la lutte contre les bactéries ?" Int J Mol Sci. 9 févr. 2024 ; 25(4) : 2107. doi : 10.3390/ijms25042107
2. Li Y, Xiao S, Huang G. "Bactériophage Acinetobacter baumannii : Progrès dans l'isolement, le séquençage du génome, la recherche préclinique et l'application clinique." Curr Microbiol. 30 avril 2023 ; 80(6) : 199. doi : 10.1007/s00284-023-03295-z
3. Jain L, Kumar V, Jain SK, Kaushal P, Ghosh PK. "Isolement de bactériophages infectant Xanthomonas oryzae pv. oryzae et caractérisation génomique du nouveau phage vB_XooS_NR08 pour le biocontrôle de la brûlure bactérienne des feuilles de riz." Front Microbiol. 2023 Mar 16;14:1084025. doi: 10.3389/fmicb.2023.1084025
4. Tang X, Zhong L, Tang L, Fan C, Zhang B, Wang M, Dong H, Zhou C, Rensing C, Zhou S, Zeng G. "Les bactériophages lysogènes codant des déterminants de résistance à l'arsenic favorisent l'adaptation des communautés bactériennes à la toxicité de l'arsenic." ISME J. Juil 2023;17(7):1104-1115. doi: 10.1038/s41396-023-01425-w
5. Senhaji-Kacha A, Bernabéu-Gimeno M, Domingo-Calap P, Aguilera-Correa JJ, Seoane-Blanco M, Otaegi-Ugartemendia S, van Raaij MJ, Esteban J, García-Quintanilla M. "Isolation et caractérisation de deux nouveaux bactériophages contre Klebsiella pneumoniae résistant aux carbapénèmes." Front Cell Infect Microbiol. 2024 29 août;14:1421724. doi : 10.3389/fcimb.2024.1421724
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7. Ross J, Topp E. "Abondance des gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactériophages après fertilisation des sols avec du fumier de vache ou des boues municipales, et preuves de transduction potentielle." Appl Environ Microbiol2015 nov;81(22):7905-13. doi : 10.1128/AEM.02363-15