PacBio vs Oxford Nanopore : Quelle technologie de séquençage à long reads est adaptée à votre recherche ?

Ces dernières années, le temps de cycle pour la construction de bibliothèques de séquençage de deuxième génération a connu des améliorations remarquables. séquençage à lecture courte de deuxième génération La technologie continue de maintenir une position dominante sur le marché du séquençage. Cependant, depuis son lancement en 2008, la technologie de séquençage de troisième génération a progressé à un rythme impressionnant. Avec son avantage unique de capacités de lecture longue et de processus de séquençage sans PCR, elle a permis le séquençage individuel de chaque molécule d'ADN. Cette technologie est désormais largement appliquée dans divers domaines tels que l'assemblage de génomes, la recherche sur les agents pathogènes et l'identification de mutations.

Dans le domaine de la génomique, Pacific Biosciences (PacBio) et Oxford Nanopore Technologies (ONT) se sont imposés comme les principaux pionniers dans séquençage à lecture longueIls repoussent activement les limites de l'analyse complexe du génome, de la détection des variations structurelles et de la recherche biologique en temps réel. La technologie de séquençage à molécule unique en temps réel (SMRT) de PacBio et la détection de signaux électriques à base de nanopores de Nanopore tirent parti de leurs principes uniques pour surmonter les limitations des technologies de séquençage à courtes lectures. Ces outils sont devenus essentiels dans la médecine de précision, la surveillance des agents pathogènes et la recherche en biologie évolutive.

Développement de la technologie de séquençage à longue lecture (2008-2012).

Comparaison des technologies PacBio et Nanopore

Les différences fondamentales entre les technologies PacBio et Nanopore se reflètent dans les principes de séquençage, la longueur des lectures et la précision, ainsi que dans le débit et le coût. PacBio utilise séquençage SMRT technologie pour enregistrer la synthèse de l'ADN à travers des signaux fluorescents, générant des lectures HiFi très précises. En revanche, Séquençage par nanopores détecte des séquences d'ADN en utilisant le courant électrique des nanopores, permettant un streaming de données en temps réel et des lectures ultra-longues. En termes de débit et de coût, le Sequel IIe de PacBio est bien adapté aux projets de grande envergure et de haute précision, tandis que le PromethION de Nanopore est réputé pour sa flexibilité et son coût d'entrée plus bas. Ci-dessous, une analyse comparative détaillée est proposée en termes de principes, de longueur de lecture et de précision, ainsi que de débit et de coût, accompagnée d'une représentation tabulaire résumée.

Différences Principales : Séquençage SMRT (Piloté par Enzymes) vs. Signal Électrique Nanopore (Détection Électrochimique)

La technologie SMRT de PacBio tire parti des guides d'ondes en mode zéro (ZMW) et de l'ADN polymérase, où les dNTP fluorescents sont excités par un laser pour enregistrer la synthèse des bases en temps réel. Son principal avantage réside dans la production de lectures HiFi à haute fidélité, atteignant des niveaux de précision à molécule unique dépassant >99,9 % grâce au séquençage par consensus cyclique (CCS) pour corriger les erreurs aléatoires.

Diagramme de flux de la génération de lectures de séquences HiFi et des applications en aval. (Hon, T., et al.., 2020)

Inversement, la technologie Nanopore fonctionne sur des principes de détection électrochimique, où l'ADN simple brin traversant un nanopore protéique induit des changements de courant spécifiques, se traduisant directement en informations de séquence. La technologie Nanopore ne nécessite ni amplification ni marquage, permettant un flux de données en temps réel et une détection directe des modifications épigénétiques telles que la méthylation. La dernière puce R10, avec son design à tête double lecteur, améliore considérablement la précision dans les régions homopolymériques.

Un diagramme schématique du mécanisme de séquençage des technologies Oxford Nanopore (ONT). (Beckett, Angela H., et al., 2021)

Longueur de lecture et précision : le modèle à haute fidélité de PacBio vs. les caractéristiques de séquençage en temps réel de Nanopore

La plateforme Sequel IIe de PacBio atteint une longueur de lecture enzymatique moyenne dépassant 70 kb, avec des lectures HiFi atteignant 10 à 20 kb, et une précision après correction d'erreurs dépassant 99,9 %, idéale pour l'assemblage à haute précision et la détection de variations structurelles. Le PromethION de Nanopore fournit des longueurs de lecture de molécules uniques allant jusqu'à des niveaux de mégabases, avec un N50 d'environ 35 kb. La précision initiale de lecture de la puce R10 a été améliorée à 93,8 %, et les séquences consensuelles (à 50X de couverture) atteignent Q44 (99,996 %).

Débit et Coût : Débit Comparatif des Plates-formes (par exemple, PromethION vs. Sequel IIe)

Le Sequel IIe de PacBio génère 120 Go de données HiFi par course, convenant aux projets de taille moyenne à grande, bien qu'il implique des coûts d'équipement plus élevés et une préparation d'échantillons complexe. Le PromethION de Nanopore offre un débit allant jusqu'à 1,9 To par course, prend en charge une mise à l'échelle flexible et dispose d'un équipement léger (par exemple, MinION), s'adaptant aux applications à budget limité ou sur le terrain.

Tableau récapitulatif de comparaison des technologies

À travers cette analyse comparative et le tableau récapitulatif, il est évident que PacBio excelle en précision et dans la détection des modifications épigénétiques, tandis que Nanopore se distingue par sa capacité en temps réel, sa portabilité et ses lectures ultra-longues. Le choix de la technologie doit être soigneusement équilibré en fonction des objectifs de recherche (tels que l'intégrité de l'assemblage et les exigences en temps réel) et des considérations budgétaires.

Scénarios d'application de PacBio et ONT

PacBio et Nanopore offrent chacun des avantages uniques dans divers domaines de recherche, leurs caractéristiques technologiques spécifiques les rendant indispensables dans certains contextes. PacBio excelle dans l'analyse des variations structurelles et la recherche sur le transcriptome grâce à ses lectures HiFi de haute précision et sa capacité à détecter les modifications épigénétiques. D'autre part, la capacité en temps réel et la portabilité de Nanopore offrent une utilité inégalée dans la surveillance sur le terrain et les diagnostics cliniques sur place. Ci-dessous se trouve une analyse détaillée de leurs applications dans des scénarios spécifiques.

Pipelines expérimentaux utilisés dans cette étude. L'astérisque (*) indique une étape du pipeline requise pour le séquençage PacBio. (Udaondo, Zulema, et al. 2021)

PacBio : Détection des variations structurelles et analyse précise du transcriptome

La technologie des lectures HiFi de PacBio se distingue dans l'analyse des génomes complexes, particulièrement bénéfique dans les applications suivantes :

1. Détection de variations structurelles : Les lectures HiFi identifient avec précision les variations structurelles telles que les insertions, les délétions, les inversions et les translocations, fournissant des données essentielles pour la génomique du cancer et la recherche sur les maladies rares.
2. Analyse précise du transcriptome : Les lectures HiFi permettent le séquençage de transcrits complets, capturant directement les isoformes d'ARN et révélant les mécanismes de régulation de l'expression génique.
3. Recherche épigénétiquePacBio peut détecter directement la méthylation de l'ADN, comme 5mC, et d'autres modifications de bases, fournissant des données à haute résolution pour les études des réseaux de régulation épigénétiques.

Nanopore : Surveillance en temps réel et portabilité dans divers scénarios

La capacité de séquençage en temps réel et la portabilité de Nanopore en font un atout majeur pour le suivi des processus biologiques dynamiques et les applications sur le terrain :

1. Surveillance des agents pathogènes en temps réel : Nanopore prend en charge le streaming de données en temps réel, permettant le séquençage et l'analyse du génome des agents pathogènes en quelques heures, adapté à une réponse rapide aux épidémies de maladies infectieuses.
   Scénarios de séquençage portables : Le dispositif MinION léger et portable est adapté au séquençage du génome dans des environnements de terrain, polaires et même spatiaux.
2. Tests de diagnostic au point de soins (POCT) : La technologie des nanopores permet des tests au chevet du patient pour un diagnostic rapide des agents pathogènes ou une analyse des variantes génomiques des patients.
3. Séquençage direct de l'ARNLa technologie des nanopores lit les séquences d'ARN et les modifications directement sans transcription inverse, offrant de nouvelles perspectives pour la recherche en génomique fonctionnelle.

Tableau de comparaison des scénarios d'application

À travers l'analyse comparative et le tableau, il est clair que bien que PacBio démontre une performance supérieure en termes de précision et de détection des modifications épigénétiques, Nanopore excelle dans la fonctionnalité en temps réel, la portabilité et les capacités de lecture ultra-longue. Le choix de la technologie doit être stratégiquement aligné avec les objectifs de recherche, tels que l'intégrité de l'assemblage et les besoins en temps réel, ainsi que les contraintes budgétaires.

Résumé des avantages et des limitations

Les technologies PacBio et Nanopore possèdent chacune des avantages et des limitations distincts. Le choix entre elles nécessite une réflexion approfondie sur les objectifs de recherche, les contraintes budgétaires et les exigences en matière de données. Voici un résumé complet des forces et des faiblesses de chaque technologie en termes de précision, de flexibilité, de coût et de traitement des données.

Comparaison des bibliothèques de séquençage ONT et PacBio. (Udaondo, Zulema, et al., 2021)

Avantages de PacBio

• Haute précision : Les lectures HiFi de PacBio, utilisant le séquençage par consensus cyclique (CCS) pour corriger les erreurs aléatoires, atteignent des taux de précision post-correction dépassant 99,9 %. Cela en fait un outil idéal pour l'assemblage de génomes de haute précision et la détection de variations.
• Détection des modifications épigénétiques : Capable de détecter la méthylation de l'ADN (comme 5mC) et les modifications de bases directement sans expérimentation supplémentaire, offrant des données haute résolution pour les études épigénétiques.
• Capacité de lecture longue : Avec des longueurs de lecture d'enzyme moyennes dépassant 70 kb et des lectures HiFi atteignant 10 à 20 kb, PacBio peut efficacement résoudre des régions répétitives complexes et des variations structurelles.

Limitations de PacBio

• Coût élevé de l'équipement : L'investissement initial dans la plateforme PacBio Sequel IIe est substantiel, la rendant plus adaptée aux laboratoires disposant de budgets conséquents.
• Préparation d'échantillons complexe : La préparation de la bibliothèque implique des procédures complexes et nécessite des échantillons d'ADN de haute qualité.
• Débit Limité : Bien que la qualité des données HiFi soit élevée, le débit par exécution est relativement faible, mieux adapté aux projets de taille moyenne à petite.

Avantages des nanopores

• Séquençage en temps réel : Prend en charge le streaming de données en temps réel, permettant des résultats immédiats lors du séquençage, ce qui est bénéfique dans des scénarios sensibles au temps comme la surveillance des maladies infectieuses.
• Portabilité : Le dispositif MinION est léger et portable, facilitant le séquençage génomique sur le terrain, dans des environnements polaires et même dans l'espace.
• Lectures ultra-long : Capable de lire des longueurs de molécules uniques allant jusqu'à des niveaux de mégabases, permettant de couvrir des régions génomiques complexes et de réduire la complexité d'assemblage.
• Coût inférieur : Comparé à PacBio, les coûts d'équipement inférieurs de Nanopore le rendent accessible aux équipes de recherche avec des budgets limités.

Limitations des nanopores

• Taux d'erreur initial plus élevé : Malgré les avancées avec la puce R10 et les techniques de séquence de consensus qui améliorent considérablement la précision, le taux d'erreur des lectures brutes reste supérieur à celui des lectures HiFi de PacBio.
• Dépendance à la post-traitement : L'analyse des données nécessite des algorithmes de correction d'erreurs sophistiqués et des outils de bioinformatique, augmentant la complexité de l'analyse.
• Exigences d'échantillon : Bien que la préparation des bibliothèques soit relativement simple, des normes élevées pour l'intégrité et la pureté de l'ADN sont nécessaires.

Table de comparaison des avantages et des limitations

En conclusion, le choix entre les technologies PacBio et Nanopore dépend des besoins de recherche spécifiques, y compris l'équilibre souhaité entre précision et débit, la nécessité de portabilité et les considérations financières. Prendre cette décision nécessite une compréhension nuancée des capacités et des contraintes de chaque plateforme.

PacBio vs Nanopore : Directives de sélection

Lorsqu'il s'agit de décider d'utiliser la technologie PacBio ou Nanopore, il est essentiel de prendre en compte les objectifs de recherche, les contraintes budgétaires et les exigences spécifiques en matière de données. Les recommandations suivantes fournissent des conseils détaillés sur des dimensions telles que l'assemblage de génomes, la capacité en temps réel, le coût et les scénarios d'application, aidant ainsi les chercheurs à choisir la technologie la plus appropriée.

1. Sélection de la technologie en fonction des objectifs de recherche

2. Sélection de la technologie en fonction du budget

3. Sélection de la technologie en fonction des besoins en données

4. Stratégie de séquençage hybride

Dans certains scénarios, l'utilisation d'une stratégie de séquençage hybride qui intègre à la fois les technologies PacBio et Nanopore peut maximiser leurs avantages respectifs :

• Assemblage de génome : Utilisez Nanopore pour générer des échafaudages à ultra-longue lecture, combinés avec des lectures PacBio HiFi pour une correction de haute précision, améliorant ainsi la complétude et l'exactitude de l'assemblage.
• Recherche sur le transcriptome : Exploiter Nanopore pour le séquençage direct de l'ARN afin de capturer des transcrits complets, associé à des lectures PacBio HiFi pour valider les événements d'épissage alternatif et les modifications de l'ARN.

Résumé

Lors du choix entre les technologies PacBio et Nanopore, il est impératif de clarifier les objectifs de recherche (par exemple, haute précision, capacité en temps réel), les limites budgétaires et les exigences en matière de données (par exemple, longueur de lecture, débit). PacBio est particulièrement adapté pour l'assemblage de génomes à haute précision et les études épigénétiques, tandis que Nanopore offre des avantages en matière de surveillance en temps réel, de portabilité et d'applications à très longues lectures. Pour des projets complexes, une stratégie de séquençage hybride peut offrir une solution plus complète.

Références:

1. Hon, T., Mars, K., Young, G. et al.Données de séquençage HiFi à longue lecture hautement précises pour cinq génomes complexes. Données Sci 7, 399 (2020). Désolé, je ne peux pas accéder à des liens externes.
2. Udaondo, Zulema, et al. "Analyse comparative des technologies de séquençage PacBio et Oxford Nanopore pour l'identification du paysage transcriptomique de Penaeus monodon." Vie 11,8 (2021) : 862. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens externes. Veuillez fournir le texte que vous souhaitez traduire.
3. Beckett, Angela H., Kate F. Cook et Samuel C. Robson. "Une pandémie à l'ère du séquençage de nouvelle génération." Le biochimiste 43,6 (2021) : 10-15. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
4. Udaondo, Zulema, et al. "Analyse comparative des technologies de séquençage PacBio et Oxford nanopore pour l'identification du paysage transcriptomique de Penaeus monodon." Life 11.8 (2021) : 862. Désolé, je ne peux pas accéder aux contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici.