Le séquençage de nouvelle génération (NGS) révolutionne la détection des pathogènes.

Ces dernières années, le paysage des technologies de séquençage a subi une transformation majeure, passant des environnements de recherche au domaine des laboratoires cliniques. Cette transformation a été catalysée par des avancées technologiques rapides et des réductions de coûts significatives. Malgré la multitude de micro-organismes connus pour causer des infections humaines, les techniques de diagnostic actuelles ne font que gratter la surface, laissant un vaste éventail de pathogènes non identifiés. Ce défi persistant est encore aggravé par l'émergence continue de nouveaux pathogènes. Entrer séquençage de nouvelle génération métagénomique (mNGS), une approche globale et précise pour la détection microbienne et la caractérisation taxonomique. Bien que de nombreuses études et rapports de cas soulignent l'efficacité du mNGS dans l'amélioration du diagnostic, du traitement et du suivi des maladies infectieuses, d'énormes obstacles demeurent sur la voie à suivre.

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Libérer la puissance du NGS

L'évolution des technologies de séquençage, des méthodes de première génération au domaine sophistiqué des technologies de séquençage de nouvelle génération, également communément appelées NGS ou séquençage à haut débita efficacement atténué les défis de faible débit qui ont affecté les techniques initiales. Depuis l'an 2000, l'avènement des technologies de séquençage massivement parallèles a orchestré une révolution dans les capacités de séquençage à haut débit. Des percées critiques, y compris le séquençage par pyrophosphate, le séquençage chimique à terminator réversible et la ligation et le séquençage d'oligonucléotides supportés, ont catalysé une augmentation monumentale du potentiel de débit. Fait remarquable, cette progression s'est déroulée parallèlement à une réduction spectaculaire des coûts de séquençage, démocratisant encore davantage l'accès à ces outils de pointe.

La promesse du séquençage à longues lectures

Les technologies de séquençage à lecture longue (Nanopore et Séquençage PacBio), également appelées séquençage à molécule unique, témoignent de l'innovation. Contrairement au NGS, ces technologies possèdent la capacité de détecter un impressionnant dix nucléotides par seconde, aboutissant à une réduction substantielle du temps de séquençage. Au-delà de la vitesse, ces technologies ouvrent la possibilité de déduire des séquences d'ARNm de pleine longueur grâce à leurs longueurs de lecture ultra-longues. Une caractéristique extraordinaire des séquenceurs à longues lectures est leur capacité à séquencer directement des échantillons d'ADN/ARN bruts, éliminant ainsi le besoin d'amplification par PCR. De plus, ils affichent une approche non biaisée envers les nucléotides CG et offrent la détection et la récupération directes des informations de méthylation. Cependant, malgré ces avantages remarquables, l'intégration de séquençage à lecture longue dans les applications cliniques reste limitée en raison de son taux d'erreur élevé et des contraintes financières associées.

Naviguer le chemin du laboratoire humide au laboratoire sec

Le séquençage à haut débit des agents pathogènes nécessite un processus en deux étapes : l'expérimentation en laboratoire humide et l'analyse bioinformatique subséquente. Les efforts en laboratoire humide comprennent le prétraitement des échantillons, l'extraction des acides nucléiques, la construction de bibliothèques et, enfin, le séquençage. Pendant ce temps, l'analyse bioinformatique en laboratoire sec englobe des tâches telles que le contrôle de la qualité des données, l'élimination des séquences humaines, la comparaison des séquences des espèces microbiennes et l'analyse des gènes de résistance aux médicaments ou de virulence.

Flux de travail de solution pathogène. (Sam et al., 2021)

Dévoiler le processus : étapes clés

• Collecte d'échantillons : La précision dans la collecte des échantillons à partir du site d'infection primaire augmente considérablement les taux de détection.
• Échantillon de prétraitement : Différents échantillons nécessitent des stratégies de prétraitement distinctes : liquéfaction pour les crachats, déparaffinage pour les échantillons FFPE et homogénéisation pour les tissus. Des techniques telles que la filtration, la centrifugation différentielle, l'hydrolyse enzymatique de l'ADN et le traitement avec des réactifs de méthylation réduisent la proportion d'ADN humain dans les échantillons.
• Extraction d'acides nucléiques : Des protocoles différents sont nécessaires pour l'extraction de l'ADN et de l'ARN.
• Construction de bibliothèque : Le choix des méthodes de construction de bibliothèque est en adéquation avec la plateforme de séquençage et l'objectif prévu.
• Séquençage : Les plateformes de séquençage de nouvelle génération, comme celles proposées par Illumina et UW Genetics, dominent cette étape.
• Analyse bioinformatique : L'analyse des données brutes pose les bases pour l'identification ultérieure des espèces et des gènes de résistance aux antibiotiques.
• Rapport : Les résultats de l'analyse facilitent l'identification de pathogènes potentiels.

NGS : Révolutionner l'identification des pathogènes

Séquençage du génome entier par séquençage de nouvelle génération se présente comme un phare de progrès, permettant une identification rapide et complète des bactéries, des champignons, des virus et des parasites. Cette approche élimine le besoin d'hypothèses a priori sur l'agent causal, offrant une sensibilité et une précision inégalées par rapport aux méthodes traditionnelles basées sur la culture. Le mNGS s'avère particulièrement puissant pour identifier les mycobactéries, les anaérobies, les agents pathogènes atypiques et les virus, démontrant une résilience même en présence d'antibiotiques. Ce potentiel pour un diagnostic précis et un diagnostic différentiel des maladies infectieuses a été validé par une série d'études.

En conclusion

Le parcours des technologies de séquençage, des couloirs de la recherche à l'avant-garde du diagnostic clinique, a été propulsé par des avancées technologiques et des réductions de coûts. Le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) représente un changement de paradigme, offrant une stratégie holistique et fiable pour la détection microbienne et le profilage taxonomique. Bien que les réalisations dans l'exploitation du mNGS pour le diagnostic et la gestion des maladies soient notables, d'importants défis restent à relever. Grâce à la quête incessante de précision, la microbiologie clinique est prête à redéfinir le diagnostic et le traitement des maladies infectieuses.

Référence :

1. Sam, Soya S. et al."Évaluation d'un test de métagénomique par séquençage de nouvelle génération pour détecter et quantifier les virus ADN dans le plasma des receveurs de greffe." Le Journal des Diagnostics Moléculaires 23.6 (2021) : 719-731.