Le séquençage complet de l'ARNr 16S améliore l'analyse microbienne au niveau des espèces.

À mesure que la recherche microbiologique progresse, l'importance de l'identification au niveau des espèces dans les communautés microbiennes devient de plus en plus évidente. L'identification précise des microorganismes clés au niveau des espèces est essentielle pour la validation expérimentale ultérieure et la découverte mécanistique. Traditionnellement technologies de séquençage de deuxième génération (SGS), contraints par de courtes longueurs de lecture, capturent généralement seulement 1 à 2 régions variables de la gène 16S rRNA (par exemple, la région V3-V4). Cette limitation entrave la capacité à identifier pleinement et avec précision les espèces au sein des communautés microbiennes, rendant les analyses au niveau des espèces incomplètes. En revanche, technologie de séquençage de l'ARNr 16S en longueur complète capture toutes les neuf régions variables (V1-V9) en une seule lecture, améliorant considérablement la précision de l'annotation au niveau des espèces. Par conséquent, cette technologie offre des avantages substantiels pour la recherche sur les communautés microbiennes, en particulier dans des domaines tels que les microbiomes intestinal, respiratoire, reproductif, environnemental, d'élevage et d'aquaculture, où elle a été largement appliquée.

Démonstration du séquençage de la diversité complète de l'ARNr 16S

La figure ci-dessous compare la reconstruction d'une communauté microbienne fictive en utilisant à la fois SGS et séquençage de diversité en longueur complèteAu niveau des espèces, les résultats du SGS affichent plusieurs taxons non annotés et un manque de cohérence, tandis que les résultats de séquençage en longueur complète reconstruisent avec précision toutes les espèces présentes dans la communauté de simulation, avec des annotations cohérentes et précises.

Figure 1. Reconstruction de la communauté simulée en utilisant la diversité de deuxième génération et la diversité en pleine longueur, respectivement.

Le tableau ci-dessous présente les taux d'annotation des espèces pour des échantillons courants utilisant séquençage complet de l'ARNr 16SNotamment, les taux d'annotation au niveau des espèces pour les séquences complètes sont très satisfaisants. Pour les échantillons de fèces et de contenu intestinal, le taux d'annotation au niveau des espèces atteint 90 %, tandis que pour des échantillons environnementaux plus complexes, tels que le sol et l'eau, le taux atteint tout de même 75 %. Cela indique que la grande majorité des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) ou des séquences peuvent être annotées avec précision à des espèces spécifiques, offrant une valeur significative dans l'identification rapide des microorganismes clés dans les échantillons.

Les taux d'annotation au niveau des espèces et des genres, basés à la fois sur les données OTU et au niveau des lectures, démontrent clairement la performance supérieure du séquençage de diversité du 16S rRNA en pleine longueur dans la recherche sur les communautés microbiennes. Cet avantage est particulièrement évident dans les études cliniques, agricoles et environnementales, où un profilage microbien complet et précis est essentiel.

Avantages du séquençage complet de l'ARNr 16S

Les résultats pratiques décrits ci-dessus soulignent l'avantage substantiel du séquençage de la diversité du rRNA 16S en longueur complète pour identifier des organismes au niveau des espèces. D'un point de vue technique, plusieurs facteurs contribuent à cette performance améliorée.

Avantages techniques du séquençage complet de l'ARNr 16S

• La diversité complète de l'ARNr 16S en longueur intégrale Les amorces utilisées dans notre méthodologie englobent les neuf régions variables du gène 16S rRNA, atténuant ainsi le biais généralement associé à la sélection des amorces.
• Le séquençage est réalisé à l'aide de la plateforme PacBio Single Molecule, Real-Time (SMRT) en mode de séquençage par consensus circulaire (CCS), garantissant une précision de séquence dépassant 99 %. Cette approche réduit considérablement le risque de mauvaise classification aux niveaux du genre et de l'espèce, tout en améliorant la précision de l'identification taxonomique au niveau des espèces.

Figure 2. Structure de 16s

Les technologies de séquençage de deuxième génération génèrent généralement des longueurs de lecture plus courtes, ne couvrant qu'une à deux régions variables du gène 16S rRNA. En revanche, la plateforme PacBio de troisième génération produit des séquences à lecture longue avec une longueur moyenne variant de 8 à 15 kilobases (kb), permettant une couverture complète de toutes les neuf régions variables.

Figure 3. Diagramme du flux de travail de séquençage (à gauche) et démonstration de la précision de séquençage sur le site Web de PacBio (à droite)

Avantages des résultats :

1. Identification précise des espèces

2. Reconstruction précise de la composition de la communauté microbienne

En 2019, Johnson et al. ont réalisé une réévaluation complète du potentiel taxonomique du gène 16S rRNA aux niveaux des espèces et des souches, en utilisant à la fois des analyses bioinformatiques et des expériences de séquençage. Leurs résultats ont indiqué que cibler des plateformes de séquençage à lecture courte avec des régions variables du gène 16S ne fournit pas la résolution taxonomique obtenue en séquençant l'intégralité du gène (~1500 pb).

Cette conclusion met en évidence une limitation significative des méthodologies de séquençage à court terme, où seules des régions partielles du gène sont capturées. En revanche, séquençage complet de l'ARNr 16S—tel que celui permis par le séquençage continu à longues lectures de PacBio—permet une résolution beaucoup plus élevée de la différenciation au niveau des espèces et des souches, garantissant l'exactitude du profilage des communautés microbiennes.

Les auteurs ont observé que certaines régions hypervariables du gène de l'ARNr 16S étaient capables de différencier les espèces microbiennes à des degrés divers (Figure B). Cependant, le séquençage complet de l'ARNr 16S a démontré la capacité de résoudre avec précision toutes les séquences au niveau des espèces. Une comparaison des différentes régions variables a révélé des biais dans la classification taxonomique des bactéries (Figure C).

La sélection des régions variables a eu une influence significative sur le nombre d'OTUs générés lors du regroupement. Lors du regroupement des séquences à 99 % de similarité, plusieurs régions variables n'ont pas réussi à reproduire le nombre réel de taxons présents dans la communauté microbienne (Figure D).

Ces résultats soulignent les limites des approches de séquençage partiel du 16S, en particulier dans les environnements où une haute résolution taxonomique est nécessaire. Le séquençage complet du 16S, en couvrant les neuf régions hypervariables, offre une représentation plus complète et précise de la diversité microbienne.

Cas d'application du séquençage de la diversité du rRNA 16S en pleine longueur

Titre : Les communautés bactériennes de Cassiopea dans les Florida Keys partagent des taxons bactériens majeurs avec les microbiomes coralliens.

Publié dans : bioRxiv

Technologie: Analyse de la diversité du rRNA 16S en pleine longueur

En 2023, notre équipe de recherche a publié un préprint sur bioRxiv utilisant la technologie PacBio Sequel pour étudier les communautés bactériennes associées aux méduses Cassiopea dans les Keys de Floride. L'étude visait à découvrir la dynamique de ces communautés microbiennes et leurs relations avec les bactéries associées aux coraux.

Grâce à un séquençage complet du gène 16S rRNA, nous avons identifié des taxons bactériens significatifs présents à la fois dans les microbiomes de Cassiopea et des coraux voisins, tels que les Endozoicomonadaceae et les Vibrionaceae. Nos résultats ont révélé des compositions microbiennes distinctes entre les communautés internes (cavité gastrovasculaire) et externes (mucus) des méduses, la communauté interne présentant une diversité inférieure par rapport aux échantillons externes et environnementaux.

Nous avons également observé des variations spatiales dans la composition de la communauté à travers différents sites, ce qui indique que, bien que Cassiopea ne possède pas de microbiome central strict, certains taxons s'associent de manière constante à ces méduses. Cela souligne l'importance écologique de ces familles bactériennes et leur rôle potentiel dans la santé de Cassiopea.

Graphiques à barres de niveau de commande regroupés par emplacement

Graphique en mosaïque de l'identité de partition de Dirichlet (type de communauté) par site

Cette étude améliore notre compréhension des microbiomes des cnidaires et de leur signification écologique, fournissant des données fondamentales pour de futures recherches sur les dynamiques microbiennes dans les écosystèmes marins. Les implications s'étendent aux discussions sur les relations symbiotiques et la santé des écosystèmes, en particulier dans le contexte des conditions environnementales changeantes.

Titre : Un métabolite microbien améliore l'efficacité de l'immunothérapie en modulant la souche des cellules T dans le cancer pan-varié.

Journal : Cellule

Technologies Omics: Diversité complète de l'ARNr 16S, MétagénomiqueMétabolomique non ciblée, génome bactérien unique, transcriptomique unicellulaire

En mars 2024, Cell a publié une étude révolutionnaire dévoilant un nouveau mécanisme anti-cancer médié par le microbiote intestinal. Cette étude a d'abord démontré, à travers des expériences de transplantation de microbiote fécal (TMF) chez des souris, que le microbiome intestinal a une influence directe sur la réponse à la thérapie par blocage des points de contrôle immunitaire (BCI).

En utilisant le séquençage complet de l'ARNr 16S, les chercheurs ont comparé les microbiomes fécaux de souris présentant des réponses faibles et fortes à la thérapie ICB. L'analyse au niveau du genre a révélé une diminution de l'abondance des espèces de Lactobacillus dans le groupe à faible réponse. Au niveau de l'espèce, Lactobacillus johnsonii a montré l'abondance différentielle la plus significative entre les deux groupes (comme indiqué dans la figure accompagnante).

Après avoir identifié L. johnsonii comme une espèce clé, les chercheurs ont approfondi son rôle fonctionnel. Des expériences sur des animaux ont démontré que l'administration orale de L. johnsonii augmentait l'efficacité de la thérapie anti-PD-1 et augmentait la proportion d'infiltration des cellules T CD8+ dans les tumeurs. Dans des études ultérieures, utilisant la métabolomique, la génomique bactérienne et la transcriptomique unicellulaire, les auteurs ont exploré comment L. johnsonii et d'autres microbes intestinaux critiques modulent la réponse immunitaire à la thérapie contre le cancer.

Les résultats ont confirmé que L. johnsonii améliore l'efficacité de l'ICB en favorisant la synthèse de l'acide indole-3-propionique (IPA) et en augmentant l'activité des cellules T épuisées de type progéniteur (Tpex). Ces découvertes offrent de nouvelles perspectives sur la manière dont le microbiote intestinal peut être exploité pour améliorer les résultats de l'immunothérapie contre le cancer.

CD Genomics propose une gamme complète de services omiques, désormais avec des normes de livraison tout-en-un améliorées. Notre portefeuille de produits complet comprend analyse de la diversité microbienne, métagénomique, métatranscriptomique, génomique microbienne, rééchantillonnage des plantes et des animaux, transcriptomique, transcriptomique procaryote, séquençage des petits ARN, Analyse des lncRNA, séquençage de l'ensemble du transcriptome, et transcriptomique spatialeparmi d'autres.

Références :

1. Jia D, Wang Q, Qi Y, Jiang Y, He J, Lin Y, Sun Y, Xu J, Chen W, Fan L, Yan R, Zhang W, Ren G, Xu C, Ge Q, Wang L, Liu W, Xu F, Wu P, Wang Y, Chen S, Wang L. Un métabolite microbien améliore l'efficacité de l'immunothérapie en modulant la nature des cellules T dans le cancer pan. Cellule. 2024
2. Kaden Muffett, Jessica Labonte, Maria Pia Miglietta. Les communautés bactériennes de Cassiopea dans les Florida Keys partagent des taxons bactériens majeurs avec les microbiomes coralliens. Biorxiv 2023