Principes et flux de travail du séquençage des amplicons 16S/18S/ITS

Séquençage d'amplification 16S/18S/ITS utilise la plateforme de séquençage de nouvelle/troisième génération et effectue un séquençage à haut débit des produits de PCR provenant de régions spécifiques telles que 16S rDNA/18S rDNA/ITS/ gènes fonctionnels. Cela surmonte l'inconvénient de certains micro-organismes qui sont difficiles ou impossibles à cultiver, et permet d'obtenir des informations sur la structure de la communauté microbienne, les relations évolutives et la corrélation microbienne avec l'environnement dans des échantillons environnementaux.

Qu'est-ce que l'ADNr 16S / ADNr 18S / ITS ?

16s rDNA : Le 16S rDNA est une séquence d'ADN codant pour l'ARNr de la petite sous-unité des procaryotes, d'une longueur d'environ 1542 pb. Avec une taille moléculaire modérée et un faible taux de mutation, le 16S rDNA est le marqueur le plus couramment utilisé dans l'étude de la systématique bactérienne. La séquence du 16S rDNA se compose de 9 régions variables et de 10 régions conservées ; les séquences des régions conservées reflètent les relations génétiques entre les espèces, tandis que les séquences des régions variables reflètent les différences entre les espèces. Le séquençage du 16S rDNA est principalement utilisé pour analyser la diversité des bactéries ou des archées.

Fig. 1 Amorces et amplification de l'ADNr 16S

18S rADN : L'18S rADN est une séquence d'ADN codant pour l'ARNr de la petite sous-unité des ribosomes eucaryotes. Comme l'16S rADN, la séquence de l'18S rADN se compose également de régions conservées et de régions variables (V1-V9, absence de V6). Parmi les régions variables, V4 possède les informations de base de données les plus complètes et le meilleur effet de classification, c'est la plus utilisée et le meilleur choix pour les notes d'analyse du gène de l'ARNr 18S. Le séquençage de l'18S rADN reflète les différences entre les espèces parmi les organismes eucaryotes dans les échantillons donnés.

Fig.2 Amorces et rDNA 18S amplifiés

ITS : L'ITS (Espace Transcrit Interne) fait partie de la région non transcriptionnelle du gène de l'ARNr fongique. Les séquences ITS utilisées pour l'identification fongique incluent généralement ITS1 et ITS2. En raison du fait que les gènes d'ARNr 5.8S, 18S et 28S sont hautement conservés chez les champignons, tandis que l'ITS peut tolérer plus de mutations dans le processus évolutif en raison d'une pression de sélection naturelle moindre, et présente un polymorphisme de séquence extrêmement large chez la plupart des eucaryotes. En même temps, le type conservateur d'ITS est relativement cohérent au sein des espèces, et les différences entre les espèces (ou même les souches) sont évidentes. Les fragments de séquence ITS sont petits (respectivement de 350 pb et 400 pb de longueur) et faciles à analyser. Ils ont été largement utilisés dans l'analyse phylogénétique de différents champignons.

Fig.3 Amorces ITS et d'amplification

Qu'est-ce que le séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS ?

Le principe méthodologique du séquençage de fragments amplifiés utilise la technologie de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier sélectivement des fragments d'ADN cibles particuliers. En général, cela concerne les régions du gène 16S rRNA des bactéries et des archées ou les régions 18S rRNA/ITS pour les eucaryotes. Ces fragments incarnent des régions de séquence hautement conservées tout en englobant simultanément des zones de variation suffisantes, les rendant des instruments compétents pour la discernement et la différenciation de divers microbes.

Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS utilise Illumina ou Séquençage PacBio lire les produits de PCR qui sont amplifiés avec des amorces universelles appropriées d'une ou plusieurs régions de 16S/18S/ITSEn détectant la variation de séquence et l'abondance de la zone cible, il est possible d'obtenir des informations sur la classification et l'abondance des espèces, la structure des populations, l'évolution phylogénétique et la comparaison des communautés d'échantillons environnementaux. L'étude de la diversité microbienne a des implications théoriques et pratiques significatives pour comprendre les relations entre les microbes et l'environnement, la gestion environnementale, ainsi que l'exploitation des ressources microbiennes.

Avantages du séquençage des amplicons 16S/18S/ITS

Efficacité dans l'identification : Comparé aux méthodes traditionnelles d'identification telles que le clonage ou la culture, le séquençage des communautés microbiennes de 16s/18s/ITS offre une approche plus rapide et plus précise.

Vitesse : Contrairement aux méthodes traditionnelles de classification et d'identification microbienne, le séquençage d'amplicons génère des données considérables dans un laps de temps relativement court, accélérant ainsi le traitement et l'analyse des échantillons microbiens.

Haute Sensibilité : Le séquençage d'amplicons peut détecter des espèces à faible abondance au sein des communautés microbiennes, même celles qui ne représentent qu'une proportion minimale au sein de la communauté peuvent être efficacement identifiées.

Diversité : Le séquençage d'amplicons facilite l'analyse simultanée de multiples communautés microbiennes, englobant une large gamme de microbes tels que les bactéries, les archées et les champignons, favorisant ainsi son applicabilité généralisée.

Détection de double région : Cette approche offre une flexibilité dans le ciblage d'une ou plusieurs régions variables, permettant des lectures de séquences plus longues et une analyse plus précise des colonies.

Réduire les coûts : Le séquençage d'amplicons nécessite une profondeur moindre par rapport à séquençage métagénomiqued'où une meilleure rentabilité.

Quantifiable : Le séquençage d'amplicons permet une analyse quantitative des données de séquençage, déterminant l'abondance relative ou absolue des microbes, ce qui permet une évaluation quantitative de la composition de la communauté microbienne et des changements.

Flux de travail du séquençage des amplicons 16S/18S/ITS

Les étapes principales de Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS inclure l'extraction de l'ADN total à partir des échantillons, l'amplification PCR des zones cibles, la construction de bibliothèques, le séquençage et l'analyse bioinformatique.

Fig.4 Le flux de travail du séquençage des amplicons 16S/18S/ITS

Extraction d'ADN : Cela marque le processus d'obtention de l'ADN total à partir d'un échantillon donné. L'ADN extrait comprend des segments provenant de divers micro-organismes, englobant des zones du gène ciblé.

Amplification PCR ciblée : Les éléments principaux consistent en la conception des amorces, l'amplification par PCR, la purification de ses produits et l'évaluation finale de la pureté de ces produits. La conception de l'amorce doit s'intégrer de manière précise et spécifique avec la séquence située dans la région d'intérêt, souvent élaborée dans une zone conservée, afin d'assurer la spécificité de l'amplification. L'amplification par PCR implique la préparation du mélange correspondant, l'optimisation des conditions de réaction PCR, puis la soumission du mélange à la réaction d'amplification par PCR.

Le protocole PCR par excellence comprend une série de cycles, incluant des étapes de dénaturation, d'hybridation et d'élongation, permettant aux amorces de se lier au modèle d'ADN et de générer de nouvelles brins d'ADN. Les sous-produits de la réaction PCR nécessitent une purification via un kit de purification PCR, éliminant les amorces non réagies, les dNTPs et d'autres impuretés. Enfin, l'électrophorèse sur gel est utilisée pour inspecter la taille et la pureté des produits amplifiés, confirmant ainsi la présence uniquement des produits d'amplification de la région cible.

Construction de bibliothèque: Nous recommandons la méthode de construction de bibliothèque de primers fusionnés, c'est-à-dire que les primers fusionnés avec les primers de séquence cible et les séquences d'adaptateur, d'index et autres sont synthétisés à l'avance, puis les cibles d'ADN génomique sont directement amplifiées par PCR. Les bibliothèques d'amplicons sont purifiées et un pool équimolaire des bibliothèques d'amplicons est préparé. La dilution requise pour la préparation du modèle est déterminée, suivie du séquençage.

Séquençage : Les plateformes de séquençage actuelles incluent principalement Illumina Miseq/HiSeq et les plateformes de séquençage de troisième génération.

• Illumina NGS (MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000) : En raison de la limitation de la longueur de lecture, la plateforme NGS ne peut sélectionner qu'une seule région variable, deux régions variables ou trois régions variables comme régions cibles pour le séquençage. Lors du séquençage, seules les lectures (Tags) complètement séquencées peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure, donc différentes régions d'amplification doivent strictement suivre la stratégie de séquençage correspondante. Par exemple, si vous choisissez V4 pour l'analyse, le séquençage PE250 est nécessaire, mais pour les régions V1-V3, la stratégie de séquençage doit être PE300. Ce n'est qu'ainsi que l'intégralité des séquences peut être garantie. Les données brutes sont filtrées pour éliminer les lectures de faible qualité et laisser des données propres de haute qualité pour une analyse ultérieure.
• Séquençage SMRT de PacBioContrairement au séquençage de nouvelle génération (NGS), la plateforme de séquençage de troisième génération peut réaliser un séquençage en longueur complète pour 16S/18S/ITS, et son taux d'alignement des séquences et son taux de précision d'identification sont supérieurs à ceux du NGS.

Analyse bioinformatique : Les lectures sont assemblées en balises selon la relation de chevauchement entre les lectures, et les balises sont agrégées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) avec une similarité donnée, puis les OTU sont annotées en les comparant avec des bases de données.

Les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) sont souvent utilisées pour classer des groupes d'individus étroitement liés. En général, si la similarité des différentes séquences de 16S rDNA/18S rDNA/ITS est supérieure à 97 %, ces séquences peuvent être définies comme une OTU. Chaque OTU correspond à un différent séquence 16S rDNA/18S rDNA/ITSc'est-à-dire, chaque OTU correspond à une espèce. Grâce à l'analyse des OTU, la diversité microbienne et l'abondance des différents microorganismes dans l'échantillon peuvent être connues.

Ensuite, sur la base des résultats d'annotation des OTU et des espèces, une analyse de la complexité des espèces des échantillons et une analyse des différences entre les espèces sont réalisées. Une analyse basée sur les espèces, une analyse de la taille de l'effet LDA et d'autres analyses sont également fournies.

Fig.5 Le flux de travail clé du séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS

Application du séquençage des amplicons 16S/18S/ITS

L'utilisation de Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS cela s'étend sur plusieurs secteurs, y compris la biologie, la médecine, et plus encore. Ces séquences, y compris l'ARNr 16S, l'ARNr 18S et l'ITS, fonctionnent comme des empreintes moléculaires d'organismes tels que les bactéries, les archées et les champignons, reflétant ainsi la composition et la structure des communautés microbiennes. Le processus de séquençage d'amplicons sur ces séquences permet de comprendre la diversité, l'abondance et les caractéristiques de distribution du microbiote dans divers échantillons environnementaux, tels que le sol, les habitats aquatiques, la flore intestinale, etc. Cela révèle par conséquent la structure et les tendances évolutives des communautés microbiennes. De plus, Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS fournit un outil essentiel pour la classification et identification des microbesEn comparant les séquences d'amplicons avec des séquences connues dans des bases de données, des microbes inconnus peuvent être catégorisés et leur statut taxonomique ainsi que leurs relations phylogénétiques peuvent être déterminés. Cela revêt une importance significative pour l'identification de nouvelles espèces, le typage des espèces de microbes environnementaux et la détection de microbes pathogènes.

Figure 6. Analyse du réseau de la communauté microeucaryote au niveau des phylums. (Xu et al., 2020)

Les micro-organismes jouent des rôles essentiels dans la biosphère, participant au cycle de la matière et au flux d'énergie, améliorant la fertilité du sol, favorisant la santé des plantes et fonctionnant dans les intestins des animaux. En utilisant Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITSnous pouvons explorer les traits fonctionnels des communautés microbiennes, tels que ceux impliqués dans les cycles de l'azote et du carbone, ainsi que dans la synthèse de la bioluminescence, approfondissant ainsi notre compréhension de l'impact et des rôles des microbiomes au sein des écosystèmes.

Dans le diagnostic et le traitement des maladies, la communauté microbienne est étroitement liée à la santé de l'hôte. Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS peut donc servir d'outil pour le diagnostic et la thérapie des maladies. Par exemple, un déséquilibre de la microbiote intestinale est associé à des conditions telles que les maladies inflammatoires de l'intestin et les maladies auto-immunes. Le séquençage d'amplicons de la microbiote intestinale peut faciliter la compréhension de ces changements microbiens, fournissant des points de référence critiques pour le diagnostic et les stratégies de traitement des maladies. En biotechnologie et en bio-ingénierie, les micro-organismes sont largement utilisés dans des processus tels que la production fermentaire, la dépollution environnementale et la biodégradation. Grâce au séquençage d'amplicons des microbiomes, nous pouvons isoler des souches ayant des fonctions particulières, ouvrant ainsi la voie au développement de technologies biologiques efficaces et d'applications en ingénierie.

Différences entre le séquençage 16S et le séquençage métagénomique :

Principes de séquençage :

• Le séquençage 16S implique l'amplification de régions variables spécifiques (par exemple, V3-V4 ou V4) de l'ADN génomique microbien par PCR après extraction, suivie de la construction de bibliothèques et du séquençage.
• Séquençage métagénomique fragmente aléatoirement l'ADN génomique microbien en petits segments de 300 à 500 pb, ajoute des adaptateurs de séquençage aux deux extrémités des fragments, puis procède au séquençage.

Profondeur d'identification taxonomique variée :

• Les séquences obtenues par séquençage 16S ne peuvent souvent pas être annotées au niveau des espèces, tandis que le séquençage métagénomique peut identifier les microorganismes jusqu'au niveau des espèces, voire des souches.

Objectifs de recherche :

• Le séquençage 16S examine principalement la composition des espèces, les relations évolutives entre les espèces et la diversité des communautés microbiennes.
• Le séquençage métagénomique, s'appuyant sur l'analyse du séquençage 16S, permet une exploration approfondie des aspects génétiques et fonctionnels (par exemple, l'ontologie des gènes, l'analyse des voies).

Chez CD Genomics, notre équipe d'experts ayant une vaste expérience peut vous aider à comprendre pleinement les communautés microbiennes et à en tirer parti. En plus de Séquençage d'amplicon 16S/18S/ITSnous proposons également d'autres services de génomique microbienne, y compris :

Séquençage shotgun métagénomique
Séquençage métagénomique viral
Séquençage métatranscriptomique
Séquençage du génome complet microbien
Séquençage du génome viral

Références :

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