Méthodes de détection pour l'analyse des mutations génétiques

En tant que point focal de la recherche actuelle en sciences de la vie, la mutation génétique bénéficie de méthodologies de détection en évolution rapide, synonymes du domaine. Les avancées dans les techniques de détection des mutations génétiques revêtent une signification importante pour le diagnostic précoce et le traitement des maladies. L'objectif de cet article est de fournir une exposition concise des différentes méthodologies de détection des mutations génétiques couramment utilisées et de leurs principes sous-jacents. Cela vise à aider à une sélection appropriée en fonction des objectifs de test et des conditions expérimentales.

Southern blot

Conçu par l'éminent biologiste britannique Edwin Southern en 1975, l'hybridation par Southern blot est une technique pionnière développée pour la détection spécifique de l'ADN. Ancrée dans le principe fondamental de la complémentarité des bases, cette méthode exploite l'hybridation précise et sélective de deux brins simples d'acides nucléiques présentant une homologie dans certaines conditions, conduisant à la formation d'une structure à double brin. En tant que première incarnation des méthodologies de blotting, l'hybridation par Southern blot maintient une présence vitale dans le domaine de la biologie moléculaire.

Au cœur de ce mécanisme, l'hybridation par Southern blot repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. Ce processus implique des brins d'acides nucléiques qui, possédant un certain degré d'homologie, participent sélectivement à la formation de structures à double brin dans des conditions prédéterminées. À condition que le matériel cible incorpore des séquences complémentaires à la sonde, leur interaction est facilitée par un appariement précis des bases. Une fois les sondes non liées éliminées par des processus de lavage, l'identification et la quantification des fragments hybridés sont réalisées à l'aide de modalités telles que l'autoradiographie (Figure 1) ou d'autres méthodologies appropriées.

En raison de sa sensibilité et de sa spécificité supérieures, l'hybridation par Southern blot a rapidement gagné en reconnaissance en tant que méthode de détection moléculaire archétypale dans le spectre des techniques d'hybridation par sonde. Son utilité s'étend à de nombreux domaines, tels que la délimitation des mutations génétiques et l'examen des polymorphismes de longueur des fragments de restriction (RFLP).

Figure.1 Analyse par Southern blot (Rajiv Kumar et al., 2012).

PCR

Dans le domaine de la détection des mutations génétiques, la technologie du Southern blot occupe une position prépondérante depuis 1985, capable de discerner diverses formes de mutations telles que les délétions de gènes, les insertions et les recombinaisons par décalage de cadre. Cependant, sous les contraintes technologiques de cette époque, l'incapacité à amplifier artificiellement les gènes cibles dans les échantillons rendait certaines mutations indétectables par Southern blot. Par conséquent, les mutations échappant à l'examen du Southern blot nécessitaient une mutagenèse de l'ADN médiée par des oligonucléotides in vitro, suivie d'une analyse laborieuse de la séquence de l'ADN pour confirmation—une méthode caractérisée par sa complexité, sa nature chronophage et ses coûts élevés.

L'inception de la technologie de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a marqué un changement de paradigme dans le diagnostic moléculaire, en particulier en ce qui concerne la détection des mutations génétiques. Essentiellement, toutes les méthodes modernes de diagnostic moléculaire s'articulent autour de la méthodologie PCR. La mise en œuvre de la technologie PCR a entraîné des avancées substantielles dans plusieurs dimensions de la détection : elle a automatisé les procédures, réduit le temps d'analyse et considérablement renforcé la précision des résultats. En tous points, l'intégration de la technologie PCR a constitué un développement fondamental dans la recherche sur la détection des mutations génétiques.

1. ARMS-PCR

Le Système d'amplification des mutations réfractaires - Réaction en chaîne par polymérase (ARMS-PCR)également connu sous le nom de PCR spécifique à l'allèle (AS-PCR), repose sur le principe de la réaction d'extension spécifique à l'allèle. Cette technique ne se déroule que lorsque les amorces d'un allèle spécifique s'alignent avec le site de mutation, permettant ainsi la réaction d'extension. À l'échelle mondiale, la PCR-ARMS est devenue l'une des technologies les plus critiques et avancées dans le domaine de la détection moléculaire individuelle des tumeurs. Parallèlement, elle se positionne comme l'un des instruments technologiques les plus précis dans le domaine de la détection des maladies génétiques.

La distinction entre ARMS-PCR et la PCR conventionnelle réside dans la conception des amorces pour les gènes spécifiques des allèles. Deux amorces en amont ont des séquences d'extrémité 3' différentes. Pendant le processus d'amplification par PCR, les amorces en amont qui ne peuvent pas s'apparier complètement avec le modèle échouent à former des paires de bases complètement complémentaires, entraînant des incompatibilités. Une fois que cette incompatibilité atteint un certain niveau, l'extension de l'amorce est interrompue, et aucun produit d'amplification PCR de longueur spécifique ne peut être obtenu, indiquant que l'ADN modèle n'a pas de paire de bases avec l'extrémité 3' de l'amorce, et vice versa (Peng et al., 2018). Actuellement, les scientifiques ont étendu la méthodologie ARMS-PCR pour incorporer quatre amorces (Tetra-Primer ARMS-PCR), où quatre amorces PCR sont conçues simultanément, dont deux sont situées sur le site SNP à l'extrémité 3' et ont des directions opposées appartenant à différents génotypes, tandis que les deux autres sont situées en dehors du SNP (Figure 2).

Figure.2 ARMS-PCR (Ye et al., 2001)

2. PCR numérique

La PCR numérique (dPCR) incarne une technique avancée pour la quantification absolue des acides nucléiques. Considérée comme la troisième génération des technologies PCR, elle est jugée fondamentale dans le domaine des sciences de la vie et du diagnostic clinique. Ce concept a été mis en lumière pour la première fois en 1999 par les éminents Bert Vogelstein et Kenneth W. Kinzler.

La PCR digitale est un système unique qui micropartitionne les échantillons en gouttelettes, garantissant une moyenne d'une ou zéro molécule d'ADN cible dans chaque partition. Après l'amplification par PCR, la présence ou l'absence de fluorescence dans des partitions discrètes est enregistrée à l'aide d'un système binaire. Dans ce système, la présence de fluorescence est notée comme 1 et l'absence de fluorescence comme 0. L'analyse statistique subséquente des signaux de fluorescence permet une quantification absolue précise des espèces de type sauvage et mutantes dans l'échantillon testé. Ce niveau de sensibilité élevé permet la détection de mutations aussi faibles qu'une seule copie. (Figure 3)

Figure.3 Flux de travail dPCR (Cao et al., 2020)

3. GRH

L'analyse de courbe de fusion à haute résolution (HRM), inventée par le professeur Carl Wittwer de la pathologie moléculaire à l'Université de l'Utah, est une avancée technologique fondée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ; elle est spécialement conçue pour la détection de mutations génétiques et le génotypage. L'HRM repose principalement sur un système qui combine fidèlement des fragments cibles de PCR conçus à cet effet, un colorant fluorescent saturant pour ADN double brin, un système d'instrument capable d'obtenir des signaux de courbe de fusion à haute résolution régulés thermiquement, et un système d'analyse de courbe de fusion. Grâce à sa simplicité, son coût abordable, sa rapidité, son mode post-PCR en tube fermé qui réduit le risque de contamination secondaire, et sa haute sensibilité de détection, cette technique est rapidement devenue largement adoptée pour diverses analyses génétiques dans les domaines médical et autres domaines liés à la biologie.

Le principe principal de la gestion des ressources humaines exploite la propriété d'un colorant de type ADN double brin (ADNdb) saturant capable de s'intégrer dans le produit de PCR. Il implique une surveillance en temps réel du déroulement de l'ADNdb pendant le processus de chauffage, les détachements subséquents du colorant fluorescent entraînant une réduction ou une disparition totale des signaux fluorescents, et un enregistrement précis de la courbe de fusion à haute résolution. Cela permet ainsi une analyse très sensible des mutations d'échantillons. polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs)et sites de méthylation à la résolution d'une seule base.

Figure.4 Principe de GRH (Nguyen-Dumont et al., 2011)

Les limitations de la technologie HRM, similaires à d'autres méthodes de détection des mutations génétiques, incluent des difficultés à identifier des sites de mutations inconnus et une sensibilité influencée par le type de Variants de Nucleotide Unique (SNVs) dans le segment génétique examiné. Cependant, à l'instar d'autres méthodes de test génétique ciblant des fragments spécifiques de gènes, la technologie HRM offre plusieurs avantages, notamment la flexibilité, la rapidité, une haute sensibilité et un rapport coût-efficacité. De plus, elle a la capacité de détecter tous les types de mutations génétiques. Elle offre également l'adaptabilité pour augmenter le débit des tests, ce qui conserve la quantité d'échantillon utilisée, réduit le temps et le coût des tests, et minimise le risque de contamination — une solution optimale pour répondre aux exigences des tests cliniques.

4. IAT

La technologie d'amplification isotherme (IAT) est une autre méthode qui a évolué à partir de la PCR traditionnelle. Elle fonctionne à une température constante pour amplifier l'ADN, la rendant extrêmement rapide, sensible, simple, portable et très spécifique. L'IAT présente un potentiel d'application exceptionnel dans le domaine des diagnostics moléculaires, en particulier pour les tests au point de soins et le dépistage sur site. Le principe fondamental de l'IAT repose sur l'utilisation de diverses enzymes, telles que les polymérases à déplacement de brin, les spliceosomes d'ARN, etc., pour réaliser l'amplification de l'ADN dans des conditions isothermes selon un schéma d'amplification de l'ADN circulaire. Pendant l'IAT, un design approprié des amorces peut produire différentes longueurs de fragments d'ARN grâce à la fonction d'un spliceosome d'ARN. La détection de ces fragments d'ARN facilite l'analyse de mutations spécifiques au sein de la séquence d'ADN.

Figure.5 PCR et certains systèmes IAT (Boonbanjong et al., 2022)

Avec l'avancement continu des méthodologies biotechnologiques, l'IAT a donné naissance à une vaste gamme de techniques. Celles-ci incluent l'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), l'amplification par cercle roulant (RCA), l'amplification basée sur la séquence d'acide nucléique (NASBA), l'amplification isotherme de l'ADN dépendante de l'hélicase (HDA), l'amplification par polymérase recombinante (RPA), la réaction d'amplification par enzyme de coupure (NEAR), l'amplification par déplacement de brin (SDA) et la réaction de chaîne d'hybridation (HCR).

Séquençage génétique

L'essence du séquençage génétique consiste à utiliser un séquenceur de gènes pour déterminer l'arrangement des quatre nucléobases (adénine [A], thymine [T], guanine [G] et cytosine [C]) sur un gène. Le principe sous-jacent implique de marquer les quatre types de bases dans le gène avec des couleurs fluorescentes distinctes. À l'intérieur du séquenceur de gènes, un système laser active les bases dans leur ordre arrayé, où chaque type de base produit une couleur fluorescente unique. Des caméras spéciales capturent ces signaux fluorescents, ce qui permet finalement d'élucider la séquence de nucléotides au sein du gène.

Les avancées en science et en technologie ont progressivement affiné les techniques de séquençage génétique, passant de ce que nous appelons maintenant Séquençage de Sanger au plus contemporain Séquençage de nouvelle génération (NGS) et Séquençage à long terme techniques.

1. Séquençage de Sanger

En 1977, l'arrivée de la méthode de terminaison de chaîne par didésoxy proposée par Sanger et de la méthode de dégradation chimique proposée par Gilbert a marqué la naissance de la technologie de séquençage de première génération. Parmi elles, la méthode de terminaison de chaîne par didésoxy de Sanger (séquençage de Sanger) est la plus classique et l'une des méthodes les plus largement appliquées pour détecter les mutations génétiques dans la technologie de séquençage de Sanger. Pendant ce temps, la méthode de dégradation chimique a progressivement été abandonnée. Le séquençage de Sanger, ciblant la zone spécifique de l'ADN modèle à travers des amorces spécifiques et incorporant des nucléotides didésoxy (ddNTP) dans la réaction de PCR, sépare les produits d'extension par électrophorèse et détecte des marqueurs fluorescents, obtenant ainsi les informations de base à chaque position et identifiant par conséquent des mutations spécifiques dans la séquence d'ADN (Fig. 6). Considéré comme le "standard d'or" du séquençage, le séquençage de Sanger offre une précision de séquençage supérieure à celle du NGS et du TGS. De plus, il offre une précision affinée pour des longueurs de lecture de 700 à 1000 pb et peut gérer habilement des séquences répétitives. Cependant, ses principales limitations sont sa capacité à n'examiner qu'un seul modèle à la fois, et il est comparativement plus lent et plus chronophage (Zhang et al., 2021).

Figure.6 Processus de séquençage Sanger (Zhang et al., 2021)

2. NGS

Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est basé sur la technologie PCR et les puces génétiques, et utilise une technologie de séquençage parallèle à haut débit. Il permet la synthèse simultanée de millions de chaînes complémentaires de modèles séquencés et accumule des données de séquence. Le NGS utilise principalement les technologies de séquençage par synthèse (SBS) et de séquençage par ligation (SBL). Actuellement, les systèmes de séquençage Illumina sont devenus le produit NGS dominant. Le NGS détermine la séquence d'ADN en capturant la balise spéciale portée par les bases nouvellement ajoutées lors du processus de réplication de l'ADN, qui est souvent un marqueur moléculaire fluorescent. Le processus global peut être divisé en quatre étapes principales : préparation de la bibliothèque, génération de clusters d'ADN, séquençage par synthèse et analyse des données. Deux caractéristiques importantes du NGS sont le haut débit et la courte longueur de lecture. Son efficacité et ses faibles coûts de séquençage par base offrent des avantages inestimables pour les applications cliniques.

3. Séquençage à lecture longue

Séquençage à lecture longue représente une étape importante dans le domaine de la technologie de séquençage. Cette technologie émergente, fondée sur le séquençage de molécules uniques (SMS) et la technologie de séquençage parallèle massif, élimine le besoin d'amplification PCR des molécules d'ADN pendant le séquençage. Elle repose sur l'examen des signaux de réaction électrique ou chimique individuels basés sur une seule molécule, permettant ainsi le séquençage séparé de chaque molécule d'ADN. Alors que Ptechnologie acBio et Technologie des nanopores sont inclus dans le séquençage à longue lecture, un exemple de cette technologie, le système Nanopore, qui fixe des protéines nanopores sur une membrane résistive. Lorsque les acides nucléiques passent à travers le nanopore, il y a des changements dans la charge électrique. Comme le diamètre des nanopores est extrêmement petit, ne permettant qu'à un seul polymère d'acide nucléique de passer à la fois, différentes bases interfèrent avec le courant de manière distinctive en passant à travers le nanopore protéique. La surveillance en temps réel et le décodage de ces signaux de courant déterminent ensuite les séquences de bases. Le séquençage à longue lecture, étant donné sa longueur de lecture de séquençage plus longue, peut séquencer directement des échantillons d'ADN originaux, détecter des séquences d'ARN et d'ADN méthylé directement, et présente l'avantage d'une opération rapide.

Hybridation

1. POISSON

En 1986, des chercheurs ont commencé à utiliser l'isothiocyanate de fluorescéine pour marquer des sondes, qui ont ensuite été analysées au microscope à fluorescence, établissant ainsi la technique d'hybridation in situ par fluorescence (FISH). Dans ce processus, des acides nucléiques exogènes (communément appelés sondes moléculaires) s'apparient avec l'ADN ou l'ARN cible sur des cellules ou des tissus selon le principe de complémentarité des bases, formant des molécules hybrides d'acides nucléiques. Les sondes sont généralement marquées avec une molécule rapporteur, telle que la biotine ou la digoxine, sur un nucléotide spécifique. Ce marquage déclenche une réaction chimique avec des substances d'affinité spécifiques marquées à la fluorescéine, permettant la capture des signaux de sondes sous un microscope à fluorescence. Par conséquent, il devient possible de déterminer si les échantillons cibles ont subi des mutations génétiques.

2. Microanalyse génétique

La technologie des microarrays génétiques, ayant connu un développement rapide depuis le milieu des années 1990, se présente comme une technique avancée de biologie moléculaire à l'intersection de la synthèse interdisciplinaire. Principalement appliquée dans le diagnostic et le traitement des maladies ainsi que dans la recherche pharmaceutique, cette science innovante est devenue une force pivot de la recherche biomédicale contemporaine. Le principe fondamental sous-jacent à cette technologie implique la détermination de la séquence d'acides nucléiques par l'hybridation de séquences d'acides nucléiques marquées par fluorescence, avec un ensemble de séquences connues agissant comme sondes fixées sur un substrat solide. Plus précisément, lorsqu'une solution contient une séquence d'acides nucléiques marquée par fluorescence, telle que TATGCAATCTAG, et qu'elle subit un appariement complémentaire avec la sonde d'acides nucléiques correspondante immobilisée à une position spécifique sur le microarray génétique, la sonde présentant l'intensité de fluorescence la plus forte fournit des informations sur la complémentarité des séquences.

Références :

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2. Boonbanjong P, Treerattrakoon K, Waiwinya W, et al. Technologie d'amplification isotherme pour le diagnostic des maladies. Biosenseurs, 2022, 12(9) : 677.
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4. Nguyen-Dumont T, Jordheim L P, Michelon J, et al. Détection de l'expression allélique différentielle à l'aide de l'analyse de courbe de fusion à haute résolution : application au gène de susceptibilité au cancer du sein CHEK2. BMC Génomique Médicale, 2011, 4 : 1-10.
5. Peng B, Wang Q, Luo Y, et al. Une méthode PCR nouvelle et rapide pour génotyper les souris avec une mutation du récepteur de la leptine (souris db/db). Acta Pharmacologica Sinica, 2018, 39(1) : 117-123.
6. Ye S, Dhillon S, Ke X, et al. Une procédure efficace pour le génotypage des polymorphismes à un seul nucléotide. Recherche sur les acides nucléiques, 2001, 29(17) : e88-e88.
7. Zhang L, Chen F X, Zeng Z, et al. Avancées en métagénomique et son application aux microorganismes environnementaux. Frontières en microbiologie, 2021, 12 : 766364.