Aperçus complets sur l'analyse de la méthylation de l'ADN : sites, méthodes de détection et tendances de recherche actuelles

Qu'est-ce que la méthylation de l'ADN ?

Le terme Méthylation de l'ADN fait référence au processus enzymatique par lequel un groupe méthyle est transféré de la S-adénosylméthionine (SAM) à une base particulière dans la molécule d'ADN, la cytosine (C), l'adénine (A) et la guanine (G) sous l'action de la méthyltransférase de l'ADN. Ce processus induit des modifications de la structure de la chromatine, de la conformation de l'ADN, de la stabilité de l'ADN et de l'interaction entre l'ADN et les protéines, modulant ainsi l'expression des gènes. En tant que forme de modification relativement stable, la méthylation de l'ADN peut être héritée par la réplication de l'ADN sous l'action de la méthyltransférase de l'ADN, ce qui en fait un mécanisme critique en épigénétique. Par conséquent, la méthylation de l'ADN offre une méthode unique de modification de l'activité des gènes sans altérer la séquence d'ADN elle-même.

Le principe de la méthylation de l'ADN

Méthylation de l'ADN symbolise un processus critique de modification épigénétique. Cette procédure est catalysée par des ADN méthyltransférases, qui utilisent S-adénosylméthionine comme donneur de méthyle et l'ajoutent sélectivement à la cytosine dans les deux nucléotides du CG de l'ADN. Le principal résultat de ce processus est la formation de 5-méthylcytosine. Parfois, ce processus entraîne également la production de petites quantités de N6-méthyladénine et de 7-méthylguanine.

Dans le génome, environ 60 % à 90 % des sites CpG sont soumis à la méthylation, et les CpG non méthylés s'agglomèrent en îlots CpG. Fait intéressant, ces îlots CpG sont généralement situés au sein des séquences centrales des promoteurs de gènes structuraux et des sites de début de transcription. Cet agencement ajoute une facette convaincante au paysage de la régulation génomique et de l'expression des gènes.

Notamment, la méthylation de l'ADN peut induire des changements structurels de la chromatine dans les régions correspondantes du génome, entraînant la disparition des sites de clivage pour les nucléases et les enzymes de restriction au sein de l'ADN. Cette modification entraîne une spirale et une condensation élevées de la chromatine, perdant ainsi son activité transcriptionnelle. De plus, la cytosine méthylée en position 5 peut se transformer en thymine sous l'effet de la désamination. Cette transformation pourrait potentiellement conduire à des mutations de haplotypes géniques et à des erreurs de base, comme T2G. Si de telles mutations ne sont pas corrigées lors du processus de division cellulaire, elles pourraient provoquer des maladies héréditaires ou le cancer.

Il convient de souligner que la méthylation chez les organismes vivants est un processus stable et héréditaire. Cette caractéristique joue un rôle crucial dans la préservation de la stabilité génétique et de la fonctionnalité normale des cellules.

Dans l'ADN des organismes eucaryotes, la 5-méthylcytosine est la seule base chimiquement modifiée. Ses principaux sites de méthylation sont concentrés dans les clusters de dinucléotides CG, présentant une distribution non uniforme à travers le génome, désignant ainsi des régions de forte méthylation, de faible méthylation et de non-méthylation. Chez les mammifères, la mC constitue environ 2-7 % du contenu total en cytosine. Méthylation de l'ADN représente un aspect significatif de la modification épigénétique, exerçant une influence sur l'expression génétique sans altérer la séquence de l'ADN elle-même. Elle fait partie du codage extragénétique et constitue donc un mécanisme clé de l'hérédité extragénétique.

Lors de la méthylation de l'ADN, un groupe méthyle est ajouté à la molécule d'ADN, par exemple au carbone 5' de l'anneau de cytosine. Ce schéma de méthylation 5' est observé chez tous les vertébrés. Environ 1 % des bases de l'ADN dans les cellules humaines subissent une méthylation. Dans les cellules somatiques matures, la méthylation de l'ADN se produit principalement aux sites de dinucléotides CpG, tandis que la méthylation non CpG est couramment observée dans les cellules souches embryonnaires. Chez les plantes, la méthylation de la cytosine peut prendre la forme de CpG symétrique (ou CpNpG) ou de CpNpNp asymétrique (où C et G désignent des bases, p désigne un groupe phosphate, et N représente tout nucléotide).

Le statut de méthylation de cytosines spécifiques peut être détecté par séquençage au bisulfite. La méthylation de l'ADN, si elle est présente, peut entraîner un silençage des gènes et par conséquent mener à une dysfonction. Cependant, la méthylation de l'ADN est absente chez certaines espèces.

Pourquoi est-il crucial d'étudier la méthylation de l'ADN ?

Méthylation de l'ADN joue un rôle central dans la régulation de l'expression génique, par conséquent, son étude peut, au minimum, offrir des aperçus précieux sur les mécanismes contrôlant les expressions géniques. En effet, la méthylation de l'ADN est essentielle dans de nombreux processus biologiques vitaux, englobant mais ne se limitant pas au développement embryonnaire précoce, à l'imprégnation génomique, à l'inactivation du chromosome X, au silence des séquences répétées, ainsi qu'à l'origine, à la progression et à la métastase du cancer. Une exploration approfondie de la méthylation de l'ADN nous permet de comprendre plus adéquatement les mécanismes fondamentaux de ces processus vitaux.

De plus, Méthylation de l'ADN présente des applications significatives dans la recherche médicale, notamment en tant que biomarqueur pour le cancer. Par exemple, la méthylation de Septin9 est largement utilisée comme biomarqueur pour le cancer colorectal, entre autres, et son utilisation est largement reconnue dans la pratique clinique. Cela illustre non seulement les avantages potentiels de la méthylation de l'ADN dans le diagnostic des maladies, mais ouvre également la voie à ses vastes perspectives futures dans la recherche médicale et les traitements potentiels.

Modèles de méthylation de l'ADN dans les tissus normaux et tumoraux

Quelle est l'étendue de la méthylation de l'ADN ?

Pour plonger profondément dans la compréhension de l'humain. Méthylation de l'ADNNous devons évaluer ses caractéristiques fondamentales de distribution au sein du génome humain. Le génome humain comprend environ trois milliards de paires de bases, où environ 28 millions de dinucléotides CpG sont des sites principaux de méthylation de l'ADN. On estime qu'environ 60 % à 80 % de ces dinucléotides CpG subissent une méthylation. Il convient de noter que certaines zones, telles que les régions promotrices, contiennent des sites CpG à haute densité, appelés îlots CpG, qui ne présentent généralement pas de méthylation. Cependant, dans les cellules tumorales, le niveau global de méthylation diminue considérablement, variant entre 20 % et 50 %. Comparé aux cellules normales, environ 10 % à 60 % des sites CpG dans les cellules tumorales présentent des états de méthylation altérés, équivalant à environ 2,8 millions à 16,8 millions de sites CpG. Cette altération suggère que, malgré une diminution des niveaux globaux de méthylation dans les cellules tumorales, les niveaux de méthylation des sites CpG dans les régions promotrices des gènes présentent en réalité une augmentation claire.

Comment analyser la méthylation de l'ADN

Brève description des méthodes de détection de la méthylation de l'ADN.

Quelle technique est utilisée pour détecter la méthylation de l'ADN ?

Méthode de détection de la méthylation de l'ADN en détail

LC-MS/MS

Pour évaluer de manière exhaustive le niveau de méthylation à travers tout le génome, deux méthodes se distinguent : la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et l'ELISA.

LC-MS/MS implique la digestion enzymatique de l'ADN génomique en nucléotides individuels, y compris A, T, G, C, 5mC et 5hmC. Par la suite, l'utilisation du mode de surveillance de réaction multiple (MRM) en spectrométrie de masse facilite la quantification de l'abondance de chaque nucléotide, permettant ainsi de déterminer le niveau de méthylation de l'ADN (5mC%). De plus, LC-MS/MS peut détecter 5hmC. Malgré sa grande précision, cette méthode nécessite un équipement coûteux et implique des procédures opérationnelles complexes. Étant donné sa précision et sa sensibilité, LC-MS/MS sert de référence pour évaluer le contenu en 5mC à l'échelle du génome.

Bien que la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse garantisse une grande précision, elle impose également des exigences instrumentales spécifiques. De plus, les défis liés à l'assurance de l'achèvement des réactions enzymatiques durant le processus de marquage isotopique par glycosylation enzymatique introduisent des incertitudes et augmentent les coûts. Par conséquent, cette méthode trouve principalement son utilité dans des contextes de recherche.

ELISA

En utilisant une approche basée sur des anticorps, la quantification du contenu en 5mC est réalisée, accompagnée de la dérivation des niveaux de méthylation de l'ADN (5mC%) par calibration de courbes standard. La méthode de l'immunodosage par enzyme liée (ELISA) offre simplicité et rapidité, facilitée par des kits d'essai disponibles dans le commerce. Cependant, la littérature suggère que cette méthode est plus adaptée pour détecter des différences relativement substantielles dans les niveaux de méthylation.

Séquençage de la méthylation de l'ADN

Avec l'avancement de technologies de séquençage à haut débit, nous sommes désormais capables d'analyser des événements tels que la 5'-méthylcytosine et les modifications des histones au niveau du génome entier. Ces méthodologies révèlent des perspectives au-delà de ce que permettent les études génomiques conventionnelles, annonçant l'ère de "Méthylation de l'ADN séquençage." De plus, la diminution continue des coûts de séquençage et les avancées itératives des technologies de séquençage ont considérablement élargi le répertoire des méthodes de séquençage de la méthylation de l'ADN disponibles.

Actuellement, les méthodes de séquençage prédominantes dans la recherche en épigénétique incluent séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS)précis séquençage bisulfite oxydatif (oxBS-seq)versions optimisées de séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS/dRRBS/XRBS), séquençage bisulfite de génome entier à cellule unique ou à faible entrée (scWGBS), séquençage de (hydroxy)méthylation basé sur des amplicons, et séquençage par immunoprécipitation de l'ADN (hydroxy)méthylé.hMeDIP-seqCes méthodologies diverses offrent des solutions sur mesure pour diverses questions de recherche concernant la méthylation de l'ADN.

Séquençage bisulfite de l'ensemble du génome

WGBS se tient comme la référence en matière de Méthylation de l'ADN recherche, facilitant la détection précise du statut de méthylation à chaque base de cytosine (C) à travers l'ensemble du génome. Cette méthode fournit une base technique vitale pour élucider les dynamiques spatiotemporelles des modifications de méthylation de l'ADN génomique, trouvant ainsi une utilité étendue dans le déchiffrement des complexités mécaniques sous-jacentes au développement individuel, au vieillissement, à l'étiologie des maladies, et au-delà. Elle émerge comme l'approche privilégiée pour les études de méthylome à travers diverses espèces.

Les techniques conventionnelles de séquençage de la méthylation du génome entier impliquent l'utilisation de la ligase T4-DNA, qui, après fragmentation de l'ADN génomique par ultrasonication, facilite la ligature de séquences d'adaptateurs aux deux extrémités des fragments d'ADN. Un traitement ultérieur avec du bisulfite convertit les cytosines (C) non méthylées en uraciles (U), qui sont ensuite convertis en thymines (T) par amplification PCR médiée par les séquences d'adaptateurs.

Cet article sur 'Comment choisir la technologie de séquençage de la méthylation de l'ADNvous aidera à sélectionner la méthode de test de méthylation de l'ADN la plus appropriée.

Avantages clés :

Applicabilité large : Convient à la recherche sur les humains ainsi que sur la majorité des espèces animales et végétales (étant donné les génomes de référence connus).

Couverture à l'échelle du génome : Permet l'acquisition complète des données de méthylome, facilitant le cartographie précise des motifs de méthylation à travers l'ensemble du génome.

Résolution à base unique : Permet de discerner avec précision l'état de méthylation de chaque base C individuelle.

Séquençage de méthylation simplifié (RRBS/dRRBS/XRBS)

RRBS est une stratégie qui utilise des enzymes de restriction pour digérer le génome, enrichissant les régions régulatrices épigénétiques significatives telles que les promoteurs et les îlots CpG, suivie d'un séquençage au bisulfite. Cette technique augmente considérablement la profondeur de séquençage dans les régions riches en CpG, permettant une détection haute résolution dans les régions englobant les îlots CpG, les promoteurs et les éléments activateurs. En tant qu'outil fiable, efficace et économique pour Méthylation de l'ADN la recherche, elle présente une grande applicabilité prospective dans les investigations cliniques à grande échelle. Pour s'adapter aux exigences évolutives de la technologie scientifique, nous avons développé une RRBS digérée par double enzyme (dRRBS) qui peut capturer des loci CpG sur des régions plus larges, facilitant l'exploration de zones de méthylation plus étendues, y compris les rivages des CGI.

Dans un effort pour faciliter l'analyse multidimensionnelle avec un volume d'échantillon minimal, nous avons développé le séquençage bisulfite à représentation étendue (XRBS), une méthode de séquençage ciblée sur la méthylation qui enrichit la couverture des îlots CpG, des promoteurs, des enhancers et des sites de liaison CTCF. Cette méthode atteint une haute sensibilité et une réutilisabilité des échantillons, la rendant hautement évolutive et applicable à des échantillons limités et à des cellules uniques.

Avantages techniques :

Haute précision : capable de résolution à base unique dans sa plage de couverture.

Bonne répétabilité : La répétabilité de la zone de couverture entre plusieurs échantillons peut atteindre 85%-95%, ce qui la rend adaptée à l'analyse différentielle entre plusieurs échantillons.

Rentable : La zone de séquençage cible les régions riches en CpG, optimisant ainsi l'utilisation des données.

Séquençage de l'ADN bisulfite à l'échelle du génome à cellule unique (scWGBS)

L'étude de la génomique de la méthylation de l'ADN dans des échantillons unicellulaires et minimes est souvent limitée par les techniques de séquençage de bibliothèques. Les méthodes traditionnelles de construction de bibliothèques et les techniques d'amplification de l'ADN génomique unicellulaire sont difficiles à appliquer dans les protocoles d'expérimentation sur la méthylation. En utilisant une technologie basée sur l'amplification linéaire et la construction de bibliothèques en un seul tube, notre équipe a réussi à réduire le biais de bibliothèque et à réaliser avec précision des études de méthylation du génome entier dans des échantillons précieux.

La recherche sur la méthylation des cellules uniques et des échantillons extrêmement rares est principalement appliquée à l'exploration des mécanismes de développement des tumeurs, à la recherche sur le cancer, au diagnostic préimplantatoire des embryons, au développement embryonnaire précoce, à la recombinaison des cellules germinales, aux cellules souches et à l'hétérogénéité cellulaire, entre autres. Les échantillons applicables incluent les cellules uniques et les micro-cellules.

Avantages techniques :

Matériaux de départ minimaux : Utilise de l'ADN unicellulaire ou des matériaux de départ extrêmement minimaux pour la construction de bibliothèques.

Couverture de séquençage élevée : maximise l'extraction d'informations complètes sur la méthylation du génome entier, cartographiant avec précision le paysage de la méthylation.

Résolution à base unique : Capable d'analyser avec précision l'état de méthylation de chaque base de cytosine.

Séquençage bisulfite oxydatif précis (oxBS-Seq)

La hydroxyméthylation de l'ADN a récemment été identifiée comme un type innovant de modification de l'ADN qui est rapidement devenu un point focal de recherche critique. Grâce à des recherches édifiantes, il a été révélé que le séquençage au bisulfite, auparavant considéré comme la "norme d'or" pour détecter la méthylation de l'ADN, est incapable de faire la distinction entre la méthylation de l'ADN (5mC) et la hydroxyméthylation de l'ADN (5hmC). En collaboration, YeeGene et l'Université de Cambridge ont créé un oxBS-Seq qui peut non seulement détecter avec précision la méthylation de l'ADN en réduisant l'influence de l'hydroxyméthylation de l'ADN, mais aussi déterminer simultanément l'hydroxyméthylation de l'ADN avec une résolution à base unique grâce à l'utilisation d'une combinaison de bibliothèques doubles.

Principes techniquesL'oxBS-Seq oxygène 5hmC en 5fC, qui peut ensuite être transformé en 'U' par bisulfite, permettant ainsi une détection précise de 5mC. En même temps, en comparant avec les résultats de bisulfite habituels, une détection précise de 5hmC peut être réalisée.

Avantages techniquesRedéfinir le "standard d'or" dans la détection de la méthylation de l'ADN Analyse à résolution d'une seule base des modifications d'hydroxyméthylation de l'ADN à l'échelle du génome entier Une validation multi-standard présente une haute efficacité d'oxydation et un taux de conversion au bisulfite Biais expérimental minimal avec une reproductibilité exceptionnelle (R² > 0,98) Capable de répondre à une variété de besoins en applications de séquençage : séquençage bisulfite à représentation réduite oxydative (oxRRBS) et séquençage de méthylation oxydative de régions ciblées (Target-oxBS).

OxBS-seq affiche uniquement 5mC et nécessite une comparaison avec le séquençage standard au bisulfite (BS-seq) pour inférer les positions de séquence et l'abondance de 5hmC et 5mC. (Tibor A. Rauch, et al.) Manuel d'Épigénétique, 2023)

Séquençage de la méthylation (hydroxyméthylation) des amplicons

Le séquençage basé sur les amplicons de méthylation et d'hydroxyméthylation cible des séquences d'ADN spécifiques dans le génome en utilisant des amorces d'amplification spécifiques à la méthylation, telles que celles pertinentes pour des gènes d'intérêt particuliers. Après le traitement (oxydatif) au bisulfite de l'ADN génomique, l'amplification par PCR précède le profilage du statut de méthylation au sein des régions géniques avec un niveau d'exactitude exceptionnel, facilité par le séquençage à haut débit de nouvelle génération.

Avantages techniques :

Haute précision : Cette technique est capable d'analyser quelques à plusieurs centaines de gènes/sites CpG, atteignant une résolution d'un seul nucléotide dans la plage ciblée. Elle se distingue également par une profondeur de couverture supérieure (couverture moyenne des sites >300X).

Économique : Offrant un coût faible et un délai d'exécution rapide, cette technique allie une efficacité économique exceptionnelle et une valeur scientifique.

Spécificité : Adapté à la détection des états de méthylation à des gènes ou sites spécifiques.

Applicabilité large : Il est largement utilisé dans des échantillons cliniques pour le dépistage, la validation et les applications cliniques translationnelles des biomarqueurs de méthylation.

hMeDIP-Seq

hMeDIP-seq, un terme dérivé de la méthylation de l'ADN, se rapporte à la modification de base innovante 5hmC, formée par l'oxydation de 5mC par l'enzyme produite par la famille TET. Non seulement 5hmC a le potentiel de contribuer au contrôle de l'expression génique en réduisant l'affinité entre l'ADN méthylé et le domaine de liaison Methyl CpG (MBD) de la protéine MeCP, mais il joue également un rôle crucial dans le processus de déméthylation de l'ADN.

La technique hMeDIP-Seq fonctionne en exploitant un anticorps spécifique de l'hydroxyméthylcytosine 5' pour enrichir les fragments d'ADN hydroxyméthylés. Ce processus est ensuite combiné avec le séquençage à haut débit pour localiser rapidement et efficacement les régions hydroxyméthylées à l'échelle du génome entier avec un ensemble de données plus petit. Son utilité est vaste, s'étendant à l'étude de la relation entre l'hydroxyméthylation et les maladies ainsi qu'à son rôle dans le développement embryonnaire.

Cette technologie présente de nombreux avantages : une large plage de détection qui permet l'identification des zones de modifications méthylées à travers tout le génome ; une forte spécificité qui permet la détection ciblée des régions avec des modifications méthylées dans le génome ; et un avantage économique avec un ensemble de données de séquençage réduit, ce qui diminue les coûts de séquençage.

EM-seq

En ce qui concerne l'Enzymatic Methyl-seq (EM-seq), il atténue une limitation majeure de la norme de référence de longue date pour l'analyse du méthylome, WGBSLes réactions chimiques du bisulfite compromettent l'intégrité de l'ADN, entraînant une fragmentation et une perte de l'ADN. L'EM-seq surmonte cet inconvénient grâce à un traitement enzymatique de l'ADN pour la construction de bibliothèques WGBS. Dans la première étape, l'enzyme TET2 et des agents d'oxydation améliorants transforment 5mC et 5hmC en 5-carboxylcytosine (5caC), protégeant ainsi les cytosines modifiées. Dans la deuxième étape, la désaminase APOBEC traite les cytosines sans impacter 5caC, permettant ainsi la détection de 5mC et 5hmC.

Pyroséquençage

La pyroséquençage, également connue sous le nom de séquençage synthétique, utilise la conversion au bisulfite suivie de la pyroséquençage pour détecter les altérations de l'ADN dans des zones cibles spécifiques après conversion avec le bisulfite. La quantification des niveaux de 5mC est réalisée en comparant le rapport de la cytosine (C) à la thymine (T) à des loci génétiques individuels. Cette technique de séquençage évite le besoin de toute forme spéciale de marquage fluorescent ou d'électrophorèse, offrant ainsi une facilité d'opération. Avec une répétabilité et une précision de séquençage comparables à celles du séquençage de Sanger, la pyroséquençage est capable d'atteindre une vitesse cent fois supérieure. Cependant, la dépendance de la technique à la détection de la luminescence instantanée limite son débit plus élevé, et sa précision dans la détection des homopolymères est suboptimale. À mesure que la longueur de l'homopolymère augmente, le potentiel d'erreur augmente également. La pyroséquençage est le plus adaptée pour le séquençage rapide de courtes séquences d'ADN connues allant de 20 à 50 paires de bases.

Séquençage assisté par TET avec du pyridineborane

La séquençage assisté par TET avec pyridine-borane (TAPS) représente un changement innovant par rapport au cadre conventionnel de conversion utilisant des sels de bisulfite. TAPS opte pour une approche plus directe, convertissant les cytosines méthylées (C) en thymine (T) avant le séquençage. La conversion de C en T est facilitée par une combinaison de réactions enzymatiques et chimiques. Tout d'abord, l'enzyme d'oxydation TET1 convertit 5mC et 5hmC en 5-acide carboxylique cytosine (5caC). Ensuite, par l'action du réducteur pyridine borane, cela est transformé en dihydrouracile (DHU), un composé qui sert de modèle pour la PCR. L'ADN polymérase, qui peut identifier l'uracile (U), reconnaît le DHU. Par conséquent, après le processus de PCR, un produit de PCR ayant subi une transformation de C en T est généré.

TAPS offre un avantage distinct.: son approche non destructive envers l'ADN. Elle réduit la perte d'ADN, augmentant ainsi la complexité ou la couverture des données de séquençage. Après conversion, des fragments d'ADN allant jusqu'à 10 kilobases peuvent être conservés, rendant le TAPS hautement applicable pour le séquençage de troisième génération. Étant donné sa méthode de conversion des cytosines méthylées en thymine, l'impact qu'elle a sur l'équilibre des bases de la séquence d'ADN est extrêmement minime, ce qui améliore la qualité des données en aval et augmente considérablement les taux d'alignement des données. De plus, le rapport coût-efficacité de la technique TAPS s'avère supérieur à celui des méthodes traditionnelles de conversion au bisulfite.

Séquençage par nanopore

La technologie de séquençage par nanopore exploite les différences de potentiel générées lorsque des molécules uniques passent à travers des nanopores pour la détection de signaux. Le diamètre d'un nanopore est juste suffisant pour permettre le passage d'un unique polymère d'acide nucléique. Les quatre bases nucléiques, l'adénine (A), la thymine (T), la cytosine (C) et la guanine (G) - y compris celles ornées de modifications par méthylation - possèdent chacune des propriétés de charge distinctes. Par conséquent, les nucléotides portant des modifications par méthylation et leurs homologues non modifiés affichent des caractéristiques de signal électrique distinctes lorsqu'ils traversent le nanopore. Ainsi, des modèles computationnels avancés tels que l'apprentissage profond peuvent capturer les motifs de signal électrique distinctifs des molécules méthylées, ouvrant la voie à la création d'outils capables de détecter les modifications de méthylation moléculaire de l'ADN/ARN sur la base des signaux de séquençage ONT.

Puces de méthylation de l'ADN

À grande échelle, génome entier Méthylation de l'ADN les études, la méthode de puce de méthylation de l'ADN est plus viable par rapport à WGBS en raison des coûts élevés associés au séquençage et au traitement des données. Une puce de méthylation de l'ADN implique l'hybridation d'une sonde d'ADN traitée au bisulfite, la transformant en loci CpG d'intérêt enrichis en cytosine (à la fois méthylés et non méthylés).

La puce 450K effectue une conversion au bisulfite sur 0,5-1 μg d'ADN génomique. L'ADN converti s'hybride ensuite avec une matrice de deux sondes préconçues spécifiques à la méthylation : méthylée et non méthylée. La base unique de la sonde se lie à des nucléotides marqués et teintés de fluorescence (ddNTP) au site CpG 3'. La puce à billes est ensuite scannée sur un Illumina iScan pour détecter le rapport des signaux fluorescents. La proportion de méthylation de l'ADN à chaque site CpG est appelée valeur β (β), calculée comme M/(M+U+100), où M est la force du signal de méthylation, U est la force du signal non méthylé, et 100 est un décalage constant utilisé pour ajuster les valeurs β lorsque les intensités des cytosines méthylées et non méthylées sont faibles. Une valeur β de 0 signifie 0 % de méthylation, et 1 indique 100 % de méthylation au site CpG cible.

La technologie des puces de méthylation est devenue un outil essentiel dans la recherche sur la méthylation de l'ADN. Comparée au séquençage de méthylation du génome entier, la détection par puce présente des exigences d'initiation plus faibles, des cycles plus courts et la capacité de contourner les limitations liées au type d'échantillon, ce qui la rend applicable aux échantillons fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE) ainsi qu'aux précieux spécimens cliniques. Ces avantages ont fait de cette technologie un "produit phare" dans le domaine de la détection de la méthylation. Des dispositifs tels que l'Infinium Human Methylation 450 et le Methylation EPIC v1.0 (850K) ont été largement utilisés pour la collecte de données d'association à l'échelle de l'épigénome dans des études publiées, montrant une tendance à la hausse constante d'année en année.

Approche spécifique aux gènes

PCR spécifique de méthylation, MSP

MSP, ce processus permet une évaluation qualitative rapide de l'état de méthylation dans n'importe quel groupe de sites CpG au sein des îlots CpG. L'avantage principal de la MSP réside dans sa simplicité et sa rapidité. Si l'objectif est une quantification relative, on peut utiliser un marquage par colorant fluorescent, et grâce à la méthodologie qMSP, lire directement les valeurs de fluorescence et les valeurs Ct pour représenter les niveaux de méthylation.

Le principe de MSP (J G Herman et al., 1996)

MethyLight

De plus, des méthodes basées sur des sondes fluorescentes, telles que MethyLight, pourraient être utilisées. Les amorces spécifiques de méthylation sont conjuguées avec le groupe fluorescent FAM à l'extrémité 5', tandis que les amorces spécifiques non méthylées ont VIC, un autre groupe fluorescent, conjugué à l'extrémité 5'. La PCR en temps réel libère des flux constants de FAM et de VIC, permettant l'identification des états de méthylation en détectant ces deux groupes. Le degré de méthylation est déterminé quantitativement en mesurant les valeurs Ct. Chaque réaction PCR nécessite moins de 100 ng d'ADN converti par bisulfite, tandis que les résultats quantitatifs peuvent être calculés à l'aide de produits standards.

Principe de MethyLight (Anetta Sulewska) et al.,. 2007)

dPCR

La réaction en chaîne par polymérase numérique (dPCR) est une approche de quantification absolue des acides nucléiques en plein essor, basée sur des principes de comptage de singularités. Elle est progressivement utilisée pour quantifier des échantillons de méthylation à faible concentration ou traces. L'utilisation de cette méthode pour la détection de la méthylation présente plusieurs avantages distincts, notamment :

1) Haute sensibilité : la dPCR permet la détection directe de la méthylation au niveau d'une seule molécule au sein d'un vaste éventail d'unités de micro-réaction, contournant ainsi la nécessité de vecteurs de sous-clonage requis dans le séquençage Sanger. Cela est particulièrement adapté pour détecter des échantillons à faible abondance ou des sites de méthylation rares.

2) Quantification directe : Contrairement à MethyLight, la dPCR élimine la nécessité de construire des courbes standard. Elle quantifie directement les concentrations en nombre de copies des échantillons d'ADN méthylé, ce qui entraîne des résultats de quantification moins influencés par l'efficacité de l'amplification PCR.

3) Capacité robuste anti-interférence : En répartissant l'échantillon de manière uniforme dans des milliers d'unités de micro-réaction, les inhibiteurs de PCR présents dans les échantillons sont considérablement dilués, minimisant ainsi l'interférence avec les réactions de PCR.

À la lumière de ces caractéristiques, la PCR numérique est particulièrement adaptée au dépistage et à la validation des niveaux de méthylation dans des échantillons d'ADN traces au sein de matrices complexes, telles que des échantillons inclus dans de la paraffine ou des échantillons d'ADN circulant libre (cfDNA) dérivés du plasma. Par conséquent, un nombre croissant de chercheurs adoptent des techniques de PCR numérique pour la détection de la méthylation de l'ADN.

Amplification PCR en temps réel basée sur MethyLight numérique. (Daniel J Weisenberger) et al.,. 2008)

Digestion par des enzymes de restriction de méthylation

Cette méthode exploite la propriété des endonucléases de restriction par méthylation pour laisser les régions méthylées non digérées, fracturant ainsi l'ADN en segments de tailles disparates pour une analyse ultérieure. HpaII-MspI, reconnaissant la séquence CCGG, est une paire d'enzymes représentative couramment utilisée pour cette tâche. Par la suite, les produits isolés sont soumis à un transfert de Southern ou à une amplification par PCR pour déterminer le statut de méthylation des fragments ciblés.

Des sondes méthylées et non méthylées, conçues respectivement avec des sections d'oligonucléotides contenant des séquences hybrides de longueur variable, sont hybridées séparément avec l'ADN test. Les sondes attachées à l'ADN sont liées par une ligase. Si des sites de méthylation existent dans le fragment d'ADN, la sonde avec le site de reconnaissance HpaII ne peut pas être clivée. Au contraire, si l'ADN est non méthylé, le fragment est clivé par HpaII et la sonde ne peut pas être liée. Par conséquent, dans le processus d'amplification PCR qui suit, seules les sondes liées peuvent être amplifiées. L'analyse finale des fragments amplifiés révèle l'état de méthylation de sites spécifiques dans l'ADN original.

Cette méthode présente plusieurs avantages : tout d'abord, le volume d'échantillon requis est minimal. En raison des courtes séquences de reconnaissance des sondes, cette méthode est adaptée à l'ADN décomposé locorégionalement, comme les échantillons d'ADN incorporés dans de la paraffine. Elle est également applicable pour analyser de grandes quantités d'échantillons mélangés. La limitation de cette méthode réside dans le fait que le site de liaison de la sonde est contraint par le site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction. De plus, la température de réaction optimale de l'enzyme utilisée doit être prise en compte.

Amplification par ligation dépendante de sondes multiplex spécifiques de méthylation (MS-MLPA)
(Cornelia Hömig-Hölzel et al.,. 2012)

GRH

L'analyse de fusion à haute résolution (HRM) a été initialement utilisée pour le génotypage des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), et elle a été étendue à la détection des altérations de méthylation dans l'ADN soumis à un traitement au bisulfite. En utilisant des colorants fluorescents spécifiques, elle identifie les disparités entre les bases uniques grâce à leurs caractéristiques de dénaturation différentielles. Les différences subtiles entre la 5-méthylcytosine et la cytosine se manifestent sous forme d'altérations de bases uniques dans l'ADN après traitement au bisulfite de sodium. Les niveaux de méthylation des échantillons test peuvent être estimés en comparant leurs courbes de dénaturation avec une série de courbes de contrôle tirées d'échantillons avec des pourcentages de méthylation et de non-méthylation connus. Cela peut être réalisé grâce à la conception minutieuse des amorces pour atténuer le biais de PCR.

Schéma du diagramme de détection de la fusion à haute résolution (HRM) de la méthylation (Dianna Hussmann.; Lise Lotte Hansen. 2018)

Enrichissement par affinité

Les techniques d'enrichissement par affinité, y compris l'immunoprécipitation de l'ADN méthylé (MeDIP) et la capture de protéines de domaine de liaison à la méthylation (MBD Cap), jouent des rôles significatifs dans Méthylation de l'ADN détection. MeDIP utilise un anticorps spécifique de 5-méthylcytosine pour enrichir les fragments méthylés après fragmentation et dénaturation de l'ADN. Les fragments immunoprécipités peuvent être séquencés pour une analyse ultérieure après isolement et purification. La technique MBD Cap, semblable à MeDIP, exploite des protéines liant la méthylation de l'ADN pour l'immunoprécipitation de l'ADN méthylé. Bien que similaires, les protéines enrichies diffèrent en ce sens que MeDIP se concentre généralement sur les régions hypométhylées avec une faible densité de CpG, tandis que MBD Cap enrichit typiquement les régions hautement méthylées avec une forte densité de CpG. Ces variations rendent les deux techniques inestimables dans leurs applications uniques dans la recherche sur la méthylation de l'ADN.

Méthodologies basées sur l'affinité. MeDIP : Immunoprécipitation de l'ADN méthylé ; MIRA : Essai de récupération des CGI méthylés ; MBD : Domaine de liaison à la méthylation. (Kristen Taylor) et al.,. 2010)

MassArray

La technologie du système d'analyse génétique MassARRAY combine les principes de la réaction de clivage enzymatique spécifique à la base (MassCLEAVE) et du séquençage MALDI-TOF. Comme d'autres méthodes de détection de la méthylation de l'ADN, la plateforme MassARRAY utilise de l'ADN traité au sulfite, où la cytosine (C) non méthylée est convertie en uracile (U), tandis que la cytosine méthylée reste inchangée. Les cytosines méthylées et non méthylées (transformées en U) peuvent être différenciées en raison de leurs poids moléculaires distincts. Les produits de détection résultants avec des poids moléculaires distincts sont transcodés et subissent une réaction de clivage enzymatique spécifique à la base (MassCLEAVE). Les poids moléculaires des fragments méthylés et non méthylés sont différents (distingués en fonction de la différence de poids moléculaire de 16 Da entre la base G et la base A), permettant le calcul du ratio de méthylation par spectrométrie de masse à temps de vol. MassARRAY offre un haut débit, un faible coût et une grande sensibilité. Cependant, un équipement spécial est nécessaire, et il ne parvient pas à détecter les mutations inconnues. De plus, il nécessite une conversion et une amplification par PCR, et chaque test a des exigences spécifiques concernant le nombre d'échantillons et de sites.

Technologie Sequenom MassARRAY pour l'analyse de la méthylation de l'ADN (Enrique J. Busó) et al.,. Biomarqueurs et diagnostics épigénétiques 2016)

Application de recherche sur la méthylation de l'ADN

Recherche fondamentale : Concentration sur la pathogénie des maladies

a. Cancer : Des altérations des niveaux de méthylation de nombreux gènes associés aux tumeurs entraînent le silence ou la surexpression des gènes, contribuant à la tumorigenèse. Par exemple, dans le cancer du sein, des gènes suppresseurs de tumeurs tels que BRCA1 et TP53 subissent souvent Méthylation de l'ADN, entraînant une réduction ou une perte de l'expression génique, augmentant ainsi le risque de tumorigenèse. De plus, des niveaux aberrants de méthylation de l'ADN sont étroitement associés à la malignité et au pronostic des tumeurs. Des études ont révélé que les tissus tumoraux fortement méthylés présentent généralement des taux de survie plus faibles et des risques métastatiques plus élevés par rapport aux tissus avec des niveaux de méthylation plus faibles. Par conséquent, la méthylation de l'ADN a des implications significatives pour le dépistage précoce et le diagnostic du cancer.

b. Maladies cardiovasculaires : L'expression dysrégulée des gènes méthylés et les altérations des niveaux de méthylation de l'ADN sont étroitement liées à l'apparition de maladies cardiovasculaires telles que l'hypertension, la maladie coronarienne et l'infarctus du myocarde.

c. Troubles génétiques : Certaines maladies héréditaires monogéniques comme la fibrose kystique et l'hémophilie peuvent être diagnostiquées par la méthylation.

d. Troubles mentaux : La méthylation de l'ADN pourrait également être impliquée dans la pathogénie des troubles mentaux tels que l'autisme et la schizophrénie.

e. Maladies auto-immunes : Des études suggèrent que la méthylation de l'ADN pourrait jouer un rôle dans des maladies auto-immunes telles que l'arthrite rhumatoïde et le lupus érythémateux systémique.

Recherche médicale translationnelle : Focus sur les biomarqueurs de maladie

a. Détection du cancer : La méthylation de l'ADN représente un domaine clé dans la recherche sur le cancer, caractérisé par des motifs de méthylation uniques à travers différents types de cancer. L'évaluation du statut de méthylation de l'ADN dans les tissus cancéreux peut être exploitée pour un diagnostic précoce, une évaluation du pronostic et un suivi des récidives. Par exemple, dans le cancer du poumon, le cancer colorectal, le cancer du sein et d'autres malignités, la prédiction des taux de survie des patients et des risques de récidive peut être réalisée grâce à la détection du statut de méthylation dans des gènes spécifiques.

b. Détection des maladies génétiques : La méthylation de l'ADN trouve des applications dans la détection des maladies génétiques. Par exemple, l'examen du statut de méthylation de certains gènes aide au diagnostic et au dépistage des maladies héréditaires monogéniques telles que la fibrose kystique et l'hémophilie.

c. Détection des troubles mentaux : Des recherches suggèrent une association potentielle entre la méthylation de l'ADN et l'apparition de troubles mentaux tels que l'autisme et la schizophrénie. Le profilage du statut de méthylation de l'ADN chez les individus souffrant de troubles mentaux contribue à une compréhension plus approfondie de leur pathogénèse, offrant ainsi de nouvelles perspectives et approches pour le diagnostic et le traitement.

Dans le domaine de l'élevage animal et végétal, des progrès significatifs ont été réalisés, tirant parti des avancées en biologie moléculaire et en sciences de l'environnement.

Dans le domaine de l'élevage animal et végétal :

Recherche fondamentale : L'investigation des motifs de méthylation des espèces et leur corrélation avec divers phénomènes biologiques tels que la croissance, le développement, la résistance aux maladies, les capacités reproductives, le développement embryonnaire précoce et la sénescence constitue une pierre angulaire.

Marqueurs moléculaires : L'utilisation de la méthylation de l'ADN comme marqueur moléculaire aide les éleveurs à sélectionner des individus présentant des caractéristiques souhaitables telles que la résistance aux maladies, la résistance aux ravageurs et une haute productivité.

Édition du génome : La modulation des motifs de méthylation des génomes animaux et végétaux permet une régulation précise de l'expression génique, améliorant ainsi les traits souhaités chez ces organismes.

En ce qui concerne l'aspect environnemental :

Phytoremédiation : Certaines espèces de plantes ont la capacité d'accumuler des polluants. En manipulant le statut de méthylation de ces plantes, leur capacité à absorber et dégrader les polluants peut être augmentée, facilitant ainsi les efforts de phytoremédiation.

Dégradation microbienne : Exploiter la dégradation microbienne des polluants organiques constitue une approche essentielle dans la réhabilitation environnementale. Manipuler le statut de méthylation des micro-organismes peut renforcer leur capacité à dégrader les polluants.

Études écologiques moléculaires : L'exploration de la méthylation de l'ADN pour élucider la structure, la fonction et les schémas de succession des communautés microbiennes dans des environnements pollués contribue à une compréhension globale des caractéristiques écologiques de ces environnements, offrant une base théorique pour les stratégies de gestion de la pollution.

Références :

1. Harrison A et Parle-Mc DermottA (2011) Méthylation de l'ADN : une chronologie des méthodes et des applications. Front.Gène. 2:74.
2. Méthylation de l'ADN, Méthodes et Protocoles (Deuxième Édition)
3. Khodadadi E, Fahmideh L, Khodadadi E, Dao S, Yousefi M, Taghizadeh S, Asgharzadeh M, Yousefi B, Kafil HS. Avancées actuelles dans les méthodes d'analyse de la méthylation de l'ADN. Rech Biomed Int. 2021 Mar20; 2021:8827516.
4. Ziller MJ, Gu H, Müller F, Donaghey J, Tsai LT, Kohlbacher O, De Jager PL, Rosen ED, Bennett DA, Bernstein BE, Gnirke A, Meissner A. Cartographie d'un paysage dynamique de méthylation de l'ADN du génome humain. Nature2013 22 août ;500(7463) :477-81.
5. Smith ZD, Meissner A. Méthylation de l'ADN : rôles dans le développement des mammifères. Nat Rev Genet. Mars 2013 ; 14(3) : 204-20.
6. Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, Zabeau M, Liloglou T, Xinarianos G, Cantor CR, Field JK, van den Boom D. Analyse quantitative à haut débit des motifs de méthylation de l'ADN par clivage spécifique à la base et spectrométrie de masse. Proc Natl Acad Sci U S A2005 Nov 1;102(44):15785-90.
7. Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D, Danenberg PV, Laird PW. MethyLight : un essai à haut débit pour mesurer la méthylation de l'ADN. Acides nucléiques Res2000 Avr 15;28(8):E32.
8. Bendixen, K.K., Mindegaard, M., Epistolio, S. et al. Une technologie de qPCR pour la quantification directe de la méthylation dans l'ADN non traité. Nat Commun 14, 5153 (2023).
9. Weisenberger DJ, Trinh BN, Campan M, Sharma S, Long TI, Ananthnarayan S, Liang G, Esteva FJ, Hortobagyi GN, McCormick F, Jones PA, Laird PW. Analyse de la méthylation de l'ADN par séquençage génomique numérique au bisulfite et MethyLight numérique. Acides Nucleiques Res. Août 2008 ; 36(14) : 4689-98.