Protocole de séquençage bisulfite de génome entier (WGBS)

Traitement au bisulfite

1. Préparez le réactif en ajoutant 900 μL d'eau, 300 μL de tampon de dilution M et 50 μL de tampon de dissolution M. Dissolvez complètement la poudre en mélangeant à température ambiante pendant au moins 10 minutes. Préparez avant utilisation.
2. Mélangez 130 μL de réactif de conversion CT, 100 ng d'ADN et 1 ng d'ADN lambda non méthylé dans un tube PCR, puis ajustez le volume total à 150 μL avec de l'eau.
3. Incubez les tubes à 98°C pendant 10 minutes et à 64°C pendant 150 minutes.
4. Charge l'échantillon dans la colonne Zymo Spin avec 600 μL de tampon M-Binding.
5. Mélangez l'échantillon et le tampon M-Binding en inversant la colonne Zymo Spin.
6. Centrifugez à 10 000 ×g pendant 1 minute et jetez le surnageant.
Ajoutez 200 μL de tampon M-Désulfonation à la colonne claire et incubez à température ambiante pendant 15 minutes.
8. Transférez la colonne dans un nouveau tube.
Ajoutez 20 à 40 μL de tampon M-Elution directement dans la colonne.
10. Centrifugez pendant 30 secondes à pleine vitesse pour éluer l'ADN.
Utilisez 1 μL d'éluant pour mesurer la quantité d'ADN.

Amorçage aléatoire

1. Mélangez l'ADN traité au bisulfite, 5 μL de NEBuffer 2 10×, 4 μL de solution de dNTP et 1 μL de PEA2 N4 à 100 μM dans un tube PCR, puis ajustez le volume total à 50 μL avec de l'eau.
2. Incuber à 95°C pendant 3 minutes et à 4°C pendant 5 minutes.
Ajoutez 1 μL de fragment Klenow (exo- 3'–5') à la réaction.
4. Incubez le mélange à 4°C pendant 15 minutes, puis augmentez la température à un rythme de +1°C/min jusqu'à 37°C. Après avoir maintenu la réaction à 37°C pendant 30 minutes, inactiver l'enzyme en chauffant à 70°C pendant 10 minutes.
Ajoutez 50 μL d'AMPure XP à la réaction, laissez le tube à température ambiante pendant 5 minutes, placez le tube sur un support magnétique pour collecter les billes, puis retirez le surnageant.
6. Ajoutez 200 μL de solution de coupure à 300 pb, resuspendez les billes, placez le tube sur un support magnétique et retirez le surnageant.
7. Répétez l'étape précédente une fois.
8. Après avoir rincé les billes avec 200 μL d'éthanol à 70 % (v/v), éluez l'ADN avec 12 μL de Tris–HCl à 10 mM, pH 8,5.
9. Mesurer la quantité d'ADN.

Ligation TACS

1. Mélangez 10 μL de tampon de réaction TACS 2,5×, 11 μL de l'ADN purifié à l'étape précédente, 1 μL de PA-anti-PEA1 P à 30 μM et 1 μL d'ATP à 10 mM dans un tube PCR.
2. Incuber à 95°C pendant 5 minutes et à 4°C pendant 5 minutes.
Ajoutez 1 μL de TdT à 15 U/μL et 1 μL de CircLigase II à 100 U/μL à la réaction.
4. Incuber à 37°C pendant 30 minutes, à 65°C pendant 120 minutes et à 95°C pendant 5 minutes.

Extension de primer (1)

Ajoutez 5 μL de tampon universel Gene Taq 10×, 4 μL de dNTPs à 2,5 mM, 1 μL de primer d'indexation, 1 μL de Hot Start GeneTaq à 2,5 U/μL, et 14 μL d'eau à la réaction après la ligation TACS.
2. Incuber à 95°C pendant 3 min, à 45°C pendant 3 min, et à 72°C pendant 30 min.
Ajoutez 20 μL de tampon B2 et 5 μL de protéinase K à 20 mg/mL à la réaction.
4. Incuber à 50°C pendant 15 minutes.
Ajoutez 50 μL d'AMPure XP, puis incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
6. Récupérez les billes et éliminez le surnageant.
7. Lavez les billes avec 200 μL de solution de coupure.
8. Répétez l'étape précédente une fois.
9. Rincez les billes avec 200 μL d'éthanol à 70 % (v/v).
10. Retirez complètement la solution résiduelle.
Ajoutez 40 μL de Tris-acétate à 10 mM pour resuspendre les billes, placez le tube sur le support magnétique pour séparer les billes, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube PCR.
12. Mesurez la concentration en ADN.

Extension de primer (2)

Ajoutez 5 μL de tampon universel GeneTaq 10×, 4 μL de dNTPs à 2,5 mM, 1 μL de l'amorce-3 à 60 μM et 1 μL de Hot Start GeneTaq à 5 U/μL à 39 μL de l'ADN purifié à l'étape précédente.
2. Incuber à 94°C pendant 3 minutes, à 45°C pendant 5 minutes, et à 72°C pendant 30 minutes.
Ajoutez 50 μL d'AMPure XP et incubez à température ambiante pendant 5 minutes.
4. Rassemblez les billes en plaçant le tube sur un support magnétique.
5. Lavez les perles avec 200 μL de solution de coupure.
6. Répétez l'étape une fois.
7. Rincez les billes avec 200 μL d'éthanol à 70 % (v/v).
8. Retirez complètement la solution résiduelle.
9. Ajoutez 26 μL de Tris-acétate à 10 mM pour resuspendre les billes, placez le tube sur le support magnétique pour séparer les billes, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube PCR.
Prenez 1 μL de l'ADN purifié pour mesurer la concentration.

Contrôle qualité de la bibliothèque

1. Décongelez le contenu du kit de quantification de la bibliothèque à température ambiante.
2. Préparez une solution de mélange maître en mélangeant 10 μL/puits de Terra PCR Direct TB Green Premix (2×), 4 μL/puits de mélange de primers 5×, 0,4 μL/puits de colorant de référence ROX 50× et 3,6 μL/puits d'eau pour préparer une solution de mélange maître. Multipliez le volume de chaque réactif par le nombre de puits.
Dispensez 18 μL du mélange maître dans chaque tube PCR.
5. Diluez les bibliothèques avec du Tris–HCl 10 mM (pH 0,0) à des taux de dilution appropriés.
6. Ajoutez soit 2 μL de modèles, c'est-à-dire un contrôle standard sans modèle, soit des bibliothèques diluées, dans un tube PCR contenant le mélange maître.
7. Préparer la machine de PCR en temps réel.
8. Effectuez une amplification PCR avec le programme suivant : 95°C pendant 1 min ; 35 cycles d'incubations en trois étapes à 95°C pendant 10 s, 60°C pendant 15 s et 68°C pendant 45 s.
9. Préparez un dispositif d'électrophorèse.
10. Mélangez 1 μL d'ADN amplifié par PCR avec 10 μL de colorant de chargement dénaturant, incubez à 70°C pendant 5 minutes, puis chargez 5 μL d'échantillon sur un gel Novex TBE-Urea à 6 %.
11. Effectuez l'électrophorèse à 300 V.
12. Teindre le gel avec le colorant pour gel d'acides nucléiques SYBR Gold, puis prendre une photographie.

Séquençage

1. Mélangez les bibliothèques de manière appropriée.
2. Ajustez la concentration.
3. Exécutez le séquenceur.

Référence :

1. Miura F, Ito T. Étiquetage post-bisulfite avec une technique de ligature d'ADN simple brin hautement efficace[M]//Réseaux de régulation des facteurs de transcription. Humana, New York, NY, 2023 : 45-57.