oxBS-Seq, une méthode de séquençage épigénétique pour distinguer 5mC et 5mhC

Afin de distinguer entre la 5-méthylcytosine (5mC) et la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), séquençage bisulfite oxydatif (oxBS-Seq)) fournit une étape d'oxydation supplémentaire au bisulfite. Initialement, 5hmC est oxydé dans l'ADN génomique en 5-formylcytosine (5fC). Contrairement à 5mC et 5hmC, 5fC est sensible à la désamination par le bisulfite, donc le traitement de l'ADN oxydé par le bisulfite transforme 5fC en uracile. Les cytosines restantes dans la séquence étaient 5mC et non 5hmC en utilisant le séquençage suivant. L'identification parallèle de 5mC et 5hmC est réalisée dans un processus standard de bisulfite. L'implication de 5hmC peut être déduite en contrastant ces deux séquences. Le principal avantage de l'oxBS-Seq par rapport aux méthodes enzymatiques telles que le TAB-seq est que l'oxBS-Seq n'implique pas une enzyme TET fortement engagée qui peut être coûteuse et seulement environ 95 % efficace.

Figure 1. Séquençage quantitatif de 5-formylcytosine dans l'ADN à résolution d'une seule base. (Booth, 2014)

Avantages et inconvénients du séquençage par bisulfite oxydatif

Il y a trois principaux avantages à l'oxBS-Seq. Ceux-ci impliquent (1) la méthylation des CpG et des non-CpG à une résolution d'une seule base dans tout le génome, (2) la couverture de 5mC dans des zones de répétition denses et moins denses, et (3) la distinction claire entre 5mC et 5hmC.

Mais l'oxBS-Seq a aussi ses inconvénients. Ses deux inconvénients existants sont (1) une perte significative d'ADN (99,5 %) qui peut résulter de conditions d'oxydation sévères, et (2) il doit être intégré avec séquençage au bisulfite (BS-Seq) pour différencier et évaluer C, 5mC et 5hmC.

Principes de l'oxBS-Seq

5mC est un symbole épigénétique de l'ADN qui est renforcé par des dinucléotides CpG et joue un rôle essentiel dans le silençage des gènes et la fiabilité du génome. 5mC est une marque épigénétique populaire avec des mécanismes significatifs dans la croissance, les transposons et le silençage des gènes, l'imprégnation génomique, l'inhibition des chromosomes X et la durabilité du génome. Dans de nombreuses maladies humaines, telles que le cancer, où une hypométhylation grossière est suivie d'une hyperméthylation au sein de certaines îles CpG, une méthylation anormale de l'ADN a été impliquée.

La famille d'enzymes de translocation dix-onze (TET) peut oxyder 5mC en 5hmC. Dans la déméthylation active de l'ADN, le 5hmC peut être une alternative mais pourrait également impliquer une marque épigénétique en soi. Par des techniques analytiques, les taux de 5hmC dans l'ADN génomique peuvent être calculés et tracés par l'enrichissement des portions d'ADN contenant du 5hmC qui sont ensuite séquencées. De telles méthodes ont une résolution relativement faible et ne fournissent que des informations quantifiables relatives. En utilisant le BS-Seq, le séquençage de nucléotides uniques de 5mC a été réalisé, mais le 5mC du 5hmC ne peut pas être discriminé par cette technique. Le 5hmC dérivatisé dans l'ADN génomique peut être détecté par séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT). Cependant, l'amélioration des fragments d'ADN impliquant 5hmC est nécessaire, ce qui entraîne l'échec des données quantitatives. De plus, SMRT a un taux d'erreurs de séquençage significativement élevé, et la modification de l'appel de pics est inexacte. 5mC de 5hmC peut être résolu par des protéines et des états solides. nanopores et peut séquencer de l'ADN non amplifié.

Via une oxydation chimique extrêmement sélective de 5hmC à 5fC, l'oxBS-Seq distingue entre 5mC et 5hmC. La méthode utilise également la distinction de réactivité du bisulfite entre 5hmC et 5fC. Le traitement au bisulfite crée 5fC qui est déformylé et désaminé pour établir l'uracile (qui est lu comme la thymine au stade de séquençage) contrairement à 5hmC qui ne se désamine pas. Ainsi, après l'oxBS-seq, la seule base qui n'est pas désaminée et donc lue comme une cytosine est 5mC. En conséquence, cette stratégie fournit un aperçu fiable de tous les 5mC actuels. En réalisant un BS-seq et en évaluant ses résultats avec ceux de l'oxBS-seq, l'identification subséquente de 5hmC est atteinte.

Applications et Progrès de la Recherche

Ensemble avec une multitude de techniques analytiques déjà établies pour le BS-seq, telles que le séquençage de l'ADN et les matrices de méthylation, le processus oxBS-seq peut être utilisé pour modifier l'ADN. Cette technique est indépendante du système lorsqu'elle est utilisée en conjonction avec le séquençage de nouvelle génération et est adaptée à l'évaluation de 5mC et 5hmC à une résolution de base unique, tant sur des plateformes de génome entier que sur des régions ciblées. L'oxBS-seq est compatible avec des méthodes d'amélioration et de ciblage, telles que la PCR spécifique de locus post-bisulfite et la représentation réduite du BS-seq, en plus de l'évaluation du génome entier.

Références :

1. Kirschner K, Krueger F, Green AR, Chandra T. Multiplexage pour le séquençage bisulfite oxydatif (oxBS-seq). Dans Protocoles de méthylation de l'ADN 2018. Humana Press.
2. Ecsedi S, Rodríguez-Aguilera JR, Hernandez-Vargas H. 5-Hydroxyméthylcytosine (5hmC), ou comment identifier votre cellule préférée. Épigénomes2018, 2(1).
3. Booth MJ, Marsico G, Bachman M, et al.Séquençage quantitatif de la 5-formylcytosine dans l'ADN à une résolution d'une seule base. Chimie de la nature. 2014, 6(5) : 435.
4. Booth MJ, Branco MR, Ficz G, et al.Balasubramanian S. Séquençage quantitatif de la 5-méthylcytosine et de la 5-hydroxyméthylcytosine avec une résolution à base unique. Science. 2012.
5. Schüler P, Miller AK. Séquençage de la sixième base (5‐hydroxyméthylcytosine) : l'oxydation sélective de l'ADN permet la résolution des paires de bases. Angewandte Chemie Édition Internationale. 2012, 51(43).