Un aperçu de hMeDIP-Seq, Introduction, Caractéristiques clés et Applications

Pour étudier les modifications 5hmC, hMeDIP-Seq est utilisé. C'est une petite modification de MeDIP-seq, qui se concentre sur la procédure originale de MeDIP. Bien que cette technique soit théoriquement presque identique à MeDIP-seq, en raison des connaissances biologiques considérablement distinctes qu'elle offre, elle est considérée comme une procédure différente. Les deux altérations de 5mC et 5hmC devraient être évaluées pour une compréhension détaillée des changements épigénétiques.

Grâce à l'immunoprécipitation, l'ADN méthylé est séparé de l'ADN génomique. Des anticorps anti-5hmC sont sous-cultivés et instigués avec de l'ADN génomique fragmenté, précédés par la purification de l'ADN et la préparation d'une bibliothèque pour le séquençage. Le séquençage profond offre une couverture plus élevée du génome, montrant la majorité de l'ADN hydroxyméthylé qui est immunoprécipité.

Avantages et inconvénients de hMeDIP-seq

Les avantages du hMeDIP-seq sont les suivants :

• Dans les zones répétées épaisses et moins épaisses, 5hmC est présent.
• La sélection basée sur les anticorps, en raison de la spécificité des anticorps, est autonome par rapport à la séquence et n'augmente pas la 5mC.

D'un autre côté, ses inconvénients incluent :

• En comparaison avec la résolution à base unique avec d'autres techniques, la résolution par paires de bases est inférieure (~150 pb).
• Afin de prévenir les interactions non spécifiques, la spécificité et la sélectivité des anticorps doivent être évaluées.
• Biais vers les zones qui sont hyperméthylées.

Applications et recherches de hMeDIP-Seq

La méthylation de l'ADN au niveau de la position 5 de la cytosine (5mC) est une altération épigénétique essentielle qui joue un rôle vital dans la création des mammifères et la différenciation cellulaire. Des recherches ont montré que la famille de protéines de translocation dix-onze (TET) peut éliminer cette modification apparemment stable par oxydation. La 5mC-5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), la 5-formylcytosine (5fC) et la 5-carboxylcytosine (5caC) sont oxydées par les protéines TET (5caC). La 5hmC est le composant le plus abondant in vivo parmi les trois dérivés oxydatifs de la 5mC et peut être identifiée dans presque tous les tissus et cellules des mammifères. La 5hmC est désormais considérée comme une altération épigénétique, en tant qu'un des états intermédiaires de la déméthylation de l'ADN.

Figure 1. Une illustration du cycle de méthylation de la cytosine. (Ecsedi, 2018)

La cartographie à l'échelle du génome de 5mC et 5hmC révèle les zones génomiques de ces altérations, ce qui est crucial pour élucider leurs mécanismes. Afin de caractériser l'allocation de 5hmC à l'échelle du génome dans les tissus cérébraux et les cellules souches embryonnaires, de nombreuses populations ont utilisé des méthodes de capture par affinité spécifiques à 5hmC accompagnées de séquençage de nouvelle génération (NGS) ou de puces de tiling. Néanmoins, il reste difficile d'utiliser les données d'hydroxyméthylome ADN recueillies par la méthode standard hMeDIP-seq pour effectuer une évaluation comparative directe à l'échelle du génome entre des échantillons à haute et basse abondance de 5hmC en raison de certaines restrictions inhérentes à la procédure standard hMeDIP-seq. Par exemple, la procédure standard actuelle de séquençage NGS Illumina garantit le chargement du même nombre de bibliothèques d'ADN pour la génération de clusters distincts et le séquençage d'échantillons, ce qui annule les distinctions de produit hMeDIP entre différents échantillons (en particulier pour ceux avec une abondance de 5hmC différente). De plus, les différentes étapes de la procédure standard hMeDIP-seq peuvent accroître la variance expérimentale entre les échantillons, y compris hMeDIP, la construction de bibliothèques, l'hybridation de clusters et le séquençage. De nombreuses équipes de recherche ont mis au point des techniques computationnelles élégantes pour stabiliser ou modifier les données de méthylome ADN produites à partir de divers échantillons. Cependant, le biais induit par les restrictions intrinsèques des méthodes standard MeDIP-seq ou hMeDIP-seq n'a pas encore été surmonté. Pour surmonter ces problèmes techniques, la variation dramatique des niveaux de 5hmC entre différents tissus et cellules ou pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire nécessite des stratégies et techniques innovantes.

Les hydroxyméthylomes d'ADN des cellules souches embryonnaires de souris (ESC) et des cellules progénitrices neurales extraites des ESC ont été identifiés et évalués à l'aide de hMeDIP-seq dans une enquête récente. Les scientifiques ont pu identifier différentes zones hydroxyméthylées (DHMR) entre les ESC et les NPC et ont découvert une connexion complexe entre la modification de l'hydroxyméthylation de l'ADN et les changements d'expression génique lors de l'engagement de la lignée neurale des ESC.

Références :

1. Ecsedi S, Rodríguez-Aguilera JR, Hernandez-Vargas H. 5-Hydroxyméthylcytosine (5hmC), ou comment identifier votre cellule préférée. Épigénomes2018, 2(1):3.
2. Feldmann A, Ivanek R, Murr R, et al. L'occupation des facteurs de transcription peut médiatiser le renouvellement actif de la méthylation de l'ADN dans les régions régulatrices. PLoS Génétique2013, 9(12).
3. Tan L, Xiong L, Xu W, et al. Comparaison à l'échelle du génome de l'hydroxyméthylation de l'ADN dans les cellules souches embryonnaires de souris et les cellules progénitrices neuronales par une nouvelle méthode comparative hMeDIP-seq. Recherche sur les acides nucléiques2013, 41(7).
4. Stroud H, Feng S, Kinney SM, et al.La 5-hydroxyméthylcytosine est associée aux enhancers et aux corps des gènes dans les cellules souches embryonnaires humaines. Biologie du génome2011,12(6).