Séquençage au bisulfite : Introduction, caractéristiques, flux de travail et applications

Méthylation de l'ADN

La méthylation de l'ADN, un processus biologique fondamental, implique l'ajout d'un groupe méthyle à des bases spécifiques au sein de la séquence d'ADN par le biais de liaisons covalentes facilitées par la méthyltransférase de l'ADN (DNMT).

Cette modification chimique est une forme essentielle de régulation épigénétique, préservant la séquence de l'ADN tout en influençant l'activité des gènes. Elle exerce des effets profonds sur divers phénomènes biologiques, y compris l'expression génique, le développement embryonnaire, la prolifération cellulaire, la différenciation, le maintien de la stabilité du génome et la défense contre les invasions d'ADN exogène.

La méthylation de l'ADN se produit à différentes positions sur les bases de l'ADN, telles que la position C-5 de la cytosine, la position N-6 de l'adénine et la position N-7 de la guanine, catalysée par diverses enzymes de méthylation de l'ADN. Notamment, la méthylation du cinquième atome de carbone de la cytosine aux sites CpG (sites cytosine-phosphate-guanine) est largement étudiée, produisant de la 5-méthylcytosine (5-mC).

5-mC, le produit résultant, est omniprésent dans les génomes des plantes, des animaux et d'autres organismes eucaryotes, représentant l'une des formes de modification de la méthylation de l'ADN les plus largement étudiées.

Différentes méthodes d'analyse de la méthylation de l'ADN basées sur le séquençage de nouvelle génération. (Jeong et al., 2016)

Qu'est-ce que le séquençage par bisulfite (BS-seq) ?

Séquençage par bisulfite, souvent abrégé en BS-seq, est une méthode puissante utilisée pour détecter les motifs de méthylation de l'ADN avec une résolution à un seul nucléotide. En traitant l'ADN avec du bisulfite, les cytosines non méthylées sont converties en uracile, tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. Cette conversion différentielle permet aux chercheurs de distinguer les cytosines méthylées et non méthylées lors de l'analyse de la séquence d'ADN. Cette technique est cruciale pour comprendre la régulation épigénétique et son rôle dans divers processus biologiques, y compris le développement, les maladies et l'expression génique.

Le principe du génome entier BS-seq implique le traitement de l'ADN génomique avec du bisulfite de sodium, qui convertit tous les cytosines non méthylés en uracile tout en laissant les cytosines méthylés inchangés. Après le traitement au bisulfite, des amorces sont conçues pour amplifier des régions d'intérêt, généralement des îlots CpG, par PCR. Les produits de PCR résultants sont ensuite purifiés et clonés en utilisant le clonage TA. Les clones positifs sont sélectionnés et soumis à un séquençage, permettant de déterminer le statut de méthylation à chaque site CpG. Enfin, les données séquencées sont alignées avec la séquence génomique originale pour déterminer le nombre et l'emplacement des sites méthylés, ainsi que pour analyser le niveau global de méthylation.

Séquençage bisulfite oxydatif (OxBS-seq) et séquençage bisulfite standard (BS-seq). (Rauch et al., 2023)

Le flux de travail de la séquençage BS (bisulfite)

• Test de qualité des échantillons d'ADN

Les échantillons d'ADN subissent une évaluation initiale de la qualité pour garantir leur adéquation au séquençage.

• Construction de bibliothèque

L'ADN génomique est fragmenté en fragments de 100 à 300 pb par sonication.

Les extrémités de l'ADN sont réparées, une base A est ajoutée à l'extrémité 3', et des adaptateurs de séquençage sont ligaturés.

Le traitement au bisulfite est appliqué pour convertir les cytosines non méthylées en uracile.

Desalage et étapes de purification par gel sont effectuées pour sélectionner des tailles de fragments de bibliothèque appropriées.

L'amplification par PCR est réalisée pour enrichir les fragments de la bibliothèque, suivie d'un autre tour de sélection par taille.

Des contrôles de qualité sont effectués sur les bibliothèques construites.

• Séquençage

Les bibliothèques ayant passé le contrôle de qualité sont soumises à un séquençage à haut débit.

• Analyse des données

Les résultats de séquençage sont alignés sur le génome de référence.

Des séquences uniques sont extraites pour une analyse ultérieure.

Un filtrage initial des données est effectué pour éliminer les lectures de faible qualité.

• Validation des données

La quantité de données exploitables est évaluée pour garantir la conformité aux exigences du projet.

Une comparaison des données disponibles avec le génome de référence est effectuée, produisant des résultats de comparaison.

• Analyse de méthylation

Des données de comparaison vérifiées pour la qualité sont utilisées pour dériver des informations de méthylation à l'échelle du génome.

L'analyse et le traitement des informations sont effectués pour générer des résultats d'analyse standard et personnalisés.

Interprétation des résultats : Les motifs de méthylation et les variations sont interprétés dans le contexte de leur signification biologique et des implications potentielles pour les échantillons étudiés.

Avantages du séquençage BS (bisulfite)

• Fournit une couverture complète de la méthylation CpG et non-CpG à travers le génome avec une résolution à base unique.
• Permet l'analyse des motifs de méthylation dans diverses régions génomiques, y compris des séquences denses, moins denses et répétitives.

Défis de la séquençage BS

• Le traitement au bisulfite convertit les cytosines non méthylées en thymidine, réduisant la complexité de la séquence et rendant difficile la génération de comparaisons précises.
• Occurrence potentielle de positions de nucléotides (NPs) où la conversion de la cytosine en thymidine est incomplète lors du traitement au bisulfite.
• Incapable de distinguer entre la 5-méthylcytosine (5mC) et la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), entraînant une ambiguïté dans la détermination du statut de méthylation.

Alors que la technologie a progressé, de nombreuses variations de séquençage par bisulfite (BS-seq) ont émergé, chacune avec ses propres avantages et applications.

• oxBS-seq (Séquençage par bisulfite oxydé) : Comme mentionné précédemment, l'oxBS-seq implique l'oxydation de la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) en 5-formylcytosine (5fC) avant le traitement par bisulfite, permettant ainsi la détection précise de la 5-méthylcytosine (5mC).
• TAB-seq (Séquençage Bisulfite Assisté par Tet) : Cette méthode implique l'utilisation d'enzymes Tet pour oxyder 5mC en 5hmC ou en formes oxydées supplémentaires avant le traitement au bisulfite, permettant la discrimination entre différentes modifications de la cytosine.
• CMS-seq (Séquençage de la Méthylation de la Chromatine) : CMS-seq combine le séquençage au bisulfite avec l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), permettant l'analyse simultanée de la méthylation de l'ADN et des modifications des histones.
• BSPP-seq (Séquençage par Probes Padlock au Bisulfite) : Cette méthode utilise des sondes padlock pour capturer des régions cibles d'intérêt avant le traitement au bisulfite, permettant un séquençage bisulfite ciblé avec une couverture et une sensibilité améliorées.
• BS-PCR (Réaction de Polymérase en Chaîne au Bisulfite) : Cette technique implique un traitement au bisulfite suivi d'une amplification PCR de régions cibles spécifiques, permettant une analyse ciblée de la méthylation de l'ADN.
• BSAS (Séquençage d'Amplification par Bisulfite) : Semblable à la BS-PCR, la BSAS implique un traitement par bisulfite et une amplification PCR de régions cibles spécifiques, mais utilise généralement le séquençage de nouvelle génération pour une analyse à haut débit.

Séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS)

Séquençage du génome entier par bisulfite (WGBS) est une technique puissante utilisée pour l'analyse de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome. Elle offre une résolution à une seule base de la méthylation de l'ADN à travers l'ensemble du génome.

Dans le WGBS, l'ADN génomique est traité avec du bisulfite de sodium, ce qui convertit les cytosines non méthylées en uracile, tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. Après le traitement au bisulfite, un séquençage de nouvelle génération (NGS) à haut débit est utilisé pour séquencer les fragments d'ADN traités. En comparant les lectures de séquençage à un génome de référence, les chercheurs peuvent déterminer l'état de méthylation des cytosines individuelles dans l'ensemble du génome.

WGBS a été largement utilisé dans diverses espèces, y compris les humains, les plantes, les animaux et les organismes inférieurs, pour étudier les motifs de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome. Il fournit des informations précieuses sur le rôle de la méthylation de l'ADN dans la régulation des gènes, le développement, les maladies et l'évolution.

Séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS) – CD Genomics

Séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS)

Séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS) est une méthode qui consiste à enrichir des fragments riches en CCGG dans l'ADN génomique par digestion avec des enzymes de restriction. Par la suite, ces fragments enrichis, qui contiennent généralement des régions riches en CpG du génome, subissent un séquençage de méthylation à résolution d'une seule base via un traitement au bisulfite et une technologie de séquençage à haut débit. Comparé au séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS), RRBS est une approche plus rentable car elle nécessite un volume de séquençage significativement inférieur tout en fournissant des données de séquençage de méthylation précieuses. Cela rend le RRBS particulièrement adapté aux études cliniques à grande échelle impliquant une analyse de méthylation à l'échelle du génome.

En termes simplifiés, le traitement au bisulfite convertit les cytosines (C) non méthylées en uracile (U), qui sont ensuite lues comme de la thymine (T) lors du séquençage. En comparant le nombre de lectures converties en thymine avec le nombre total de lectures couvrant un site cytosine spécifique, les chercheurs peuvent calculer le taux de méthylation à ce site. Cette technique est inestimable pour l'étude de divers processus biologiques tels que le développement embryonnaire, les mécanismes de vieillissement, le développement de maladies et l'identification de loci de marqueurs épigénétiques liés aux maladies.

Séquençage bisulfite à représentation réduite – CD Genomics

Séquençage par bisulfite oxydatif (oxBS-seq)

La signification de l'hydroxyméthylation (5hmC) dans le génome des mammifères et ses implications dans divers processus biologiques tels que le développement, le vieillissement, les maladies neurodégénératives et la tumorigenèse. L'hydroxyméthylation est en effet une découverte relativement récente dans le domaine de l'épigénétique, et elle a suscité une attention significative en raison de ses rôles émergents et de ses implications potentielles.

L'un des principaux défis dans l'étude de l'hydroxyméthylation de l'ADN est de la distinguer de la méthylation de l'ADN (5mC), en particulier en utilisant des méthodes de séquençage au bisulfite conventionnelles. Comme vous l'avez mentionné, le traitement au bisulfite convertit à la fois 5mC et 5hmC en produits similaires, rendant difficile la distinction entre les deux modifications.

Séquençage bisulfite oxydatifoxBS-Seq) est une technique sophistiquée qui répond à ce défi. En oxydant chimiquement 5hmC en un produit intermédiaire différent avant le traitement par bisulfite, l'oxBS-Seq permet la détection spécifique de 5mC tout en excluant les effets de 5hmC. De plus, l'oxBS-Seq peut être combiné avec d'autres approches de séquençage pour détecter simultanément la méthylation de l'ADN et l'hydroxyméthylation avec une résolution à base unique.

Cette avancée technologique a considérablement amélioré notre capacité à disséquer l'interaction complexe entre la méthylation de l'ADN et l'hydroxyméthylation, ainsi que leurs rôles dans divers processus biologiques et maladies. oxBS-Seq tient une immense promesse pour approfondir notre compréhension de la régulation épigénétique et de ses implications pour la santé et la maladie humaines.

BSAS (Séquençage d'Amplicons par Bisulfite)

Le séquençage d'amplicons de bisulfite est une approche ciblée pour analyser les motifs de méthylation ou d'hydroxyméthylation de l'ADN dans des régions génomiques spécifiques d'intérêt. Voici comment la technique fonctionne généralement :

• Conception de primers : Les primers d'amplification spécifiques à la méthylation sont conçus pour cibler des séquences d'ADN spécifiques au sein du génome. Ces séquences correspondent souvent à des régions d'intérêt, telles que des gènes ou des éléments régulateurs.
• Traitement au bisulfite : L'ADN génomique est traité avec du bisulfite, qui convertit les cytosines non méthylées en uracile (et par la suite en thymine lors de la PCR), tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. Dans le cas de l'analyse de l'hydroxyméthylation, une étape d'oxydation supplémentaire peut être incluse pour convertir l'hydroxyméthylcytosine (5hmC) en un intermédiaire différent avant le traitement au bisulfite.
• Amplification par PCR : L'ADN traité au bisulfite est ensuite soumis à une amplification par PCR à l'aide des amorces spécifiques de méthylation. Cette étape d'amplification cible sélectivement les régions d'intérêt, ce qui entraîne la génération de fragments d'ADN correspondant à ces régions.
• Séquençage : Les fragments d'ADN amplifiés sont ensuite soumis à un séquençage à haut débit en utilisant des technologies de séquençage de nouvelle génération, telles que le séquençage Illumina. Cela permet la détection précise du statut de méthylation ou d'hydroxyméthylation des régions géniques ciblées avec une résolution à une seule base.

En se concentrant sur des régions génomiques spécifiques d'intérêt, le séquençage d'amplicons par bisulfite offre une méthode rentable et efficace pour l'analyse ciblée de la méthylation ou de l'hydroxyméthylation de l'ADN. Cette approche est particulièrement utile lors de l'étude du statut de méthylation de gènes spécifiques ou d'éléments régulateurs associés à des processus biologiques ou des maladies particuliers.

Séquençage bisulfite assisté par Tet

Le séquençage TAPS, ou séquençage bisulfite assisté par tétraazole, est une méthode innovante pour analyser les motifs de méthylation de l'ADN qui offre plusieurs avantages par rapport aux techniques de séquençage bisulfite traditionnelles.

Dans le séquençage bisulfite assisté par Tet, la conversion par bisulfite est remplacée par une approche chimique différente qui convertit directement les cytosines méthylées (5mC) en thymine (T) pour le séquençage. Cette technique utilise une combinaison de réactions enzymatiques et chimiques pour réaliser la conversion de la cytosine en thymine.

Voici comment fonctionne le séquençage par bisulfite assisté par Tet :

• Oxydation de 5mC et 5hmC : Initialement, 5mC et 5hmC sont oxydés en 5caC (5-carboxycytosine) à l'aide de l'oxydase TET1.
• Conversion en DHU : Le 5caC oxydé est ensuite converti en dihydrouracile (DHU) en présence de l'agent réducteur borane de pyridine (pyridine). Le DHU peut servir de modèle lors de l'amplification PCR.
• Amplification par PCR : Lors de l'amplification par PCR, l'ADN polymérase reconnaît le DHU comme de l'uracile (U), ce qui entraîne l'incorporation d'adénine (A) en face du site DHU. En conséquence, les cytosines dans la séquence d'ADN originale sont effectivement converties en thymines dans le produit final de la PCR.

Les avantages de la technologie TAPS incluent :

• Non destructif pour l'ADN : Contrairement à la conversion par bisulfite, le séquençage par bisulfite assisté par Tet ne dégrade pas l'ADN, entraînant une perte d'ADN moindre durant le processus.
• Amélioration de la qualité des données de séquençage : le séquençage bisulfite assisté par Tet préserve l'équilibre des bases de la séquence d'ADN, ce qui entraîne des données de séquençage de meilleure qualité avec une couverture et une complexité accrues.
• Efficacité économique : La technologie de séquençage par bisulfite assistée par Tet est généralement plus rentable que les méthodes traditionnelles de conversion par bisulfite.
• De plus, le séquençage par bisulfite assisté par Tet permet la conservation de fragments d'ADN plus longs (jusqu'à 10 kb), ce qui est bénéfique pour les applications ultérieures telles que le séquençage triple.

Dans l'ensemble, le séquençage par bisulfite assisté par Tet offre une alternative prometteuse au séquençage par bisulfite pour l'analyse de la méthylation de l'ADN, offrant une qualité de données améliorée, une réduction de la perte d'ADN et un rapport coût-efficacité avantageux.

OxBS-Seq, BS-Seq et TAB-Seq. (Schüler et al., 2012)

Séquençage par nanopore

Séquençage par nanopore est une technologie révolutionnaire qui permet le séquençage direct et en temps réel des molécules d'ADN et d'ARN.

• Détection par nanopore : Le séquençage par nanopore consiste à faire passer une molécule d'ADN ou d'ARN à travers un nanopore biologique ou à état solide. Lorsque la molécule traverse le nanopore, elle provoque des perturbations dans le courant électrique qui circule à travers le pore. Ces perturbations sont caractéristiques de la séquence de nucléotides spécifique de la molécule.
• Détection du signal : Les perturbations dans le courant électrique sont détectées et enregistrées sous forme de "zigzags" par le dispositif de séquençage par nanopore. Chaque nucléotide passant à travers le pore produit un motif de zigzag distinct, permettant de déterminer la séquence.
• Détection de la méthylation : En plus de la séquence de nucléotides, le séquençage par nanopore peut également détecter des modifications épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN. La présence de bases méthylées modifie les propriétés électriques des nucléotides, entraînant des motifs de signal uniques lorsqu'ils passent à travers le nanopore.
• Modèles d'apprentissage profond : Des algorithmes d'apprentissage profond sont utilisés pour analyser les motifs de signal complexes générés par le séquençage par nanopore. En entraînant ces modèles sur des motifs de méthylation connus, les chercheurs peuvent développer des outils qui identifient et caractérisent avec précision les modifications de méthylation dans les molécules d'ADN et d'ARN en fonction des signaux de séquençage par nanopore.

Dans l'ensemble, le séquençage par nanopores associé à des modèles d'apprentissage profond offre une approche puissante et polyvalente pour la détection directe des séquences d'ADN et d'ARN, ainsi que des modifications épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN. Cette technologie a des applications variées dans la génomique, l'épigénétique et la recherche biomédicale.

Références :

1. Rauch, Tibor A., et Gerd P. Pfeifer. "Méthodes pour analyser les modifications de cytosine de l'ADN à l'échelle du génome." Manuel d'Épigénétique. Academic Press, 2023. 123-135.
2. Schüler, Peter, et Aubry K. Miller. "Séquençage de la sixième base (5‐hydroxyméthylcytosine) : L'oxydation sélective de l'ADN permet la résolution des paires de bases." Angewandte Chemie Édition Internationale 51,43 (2012) : 10704-10707.
3. Jeong H.M., et al. Efficacité de l'immunoprécipitation de l'ADN méthylé par séquençage bisulfite pour l'analyse de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome. Épigénomique. 2016, 8(8):1061-77.