Flux de travail de séquençage de LncRNA et analyse de ses données

Introduction au séquençage des LncRNA

L'lncRNA est un ARN non codant d'une longueur supérieure à 200 nucléotides. Comparé à l'ARNm, l'lncRNA est généralement exprimé à des niveaux plus faibles et présente une spécificité tissulaire plus forte. En tant que point focal de la recherche sur l'ARN, lncARN non codant régule l'expression des gènes codants à divers niveaux, y compris l'hérédité épigénétique, la transcription et la post-transcription. Différent de l'inspection traditionnelle par puce, l'analyse des lncRNA combinée à la technologie de séquençage à haut débit et à l'analyse bioinformatique peut explorer de manière exhaustive les informations sur les lncRNA dans les échantillons. Séquençage de l'lncRNA La technologie a été largement utilisée dans l'amélioration génétique des espèces et les études sur l'occurrence, le développement, le diagnostic et le traitement des maladies.

Séquençage de l'ARN non codant long (lncRNA) implique le séquençage à haut débit d'une classe d'ARN non codants produits au sein des cellules d'une longueur dépassant 200 nucléotides. La construction de la bibliothèque est réalisée à l'aide d'une méthode qui élimine l'ARN ribosomique (ARNr), suivie du déploiement de technologies de séquençage à haut débit, soutenues par une plateforme d'analyse bioinformatique robuste. Cette approche permet des études complètes et approfondies de tous les lncARN connus ou nouveaux présents dans un échantillon donné.

L'utilisation de la construction de bibliothèques spécifiques à un brin pour les lncARNs confère à l'approche certains avantages par rapport aux techniques conventionnelles de construction de bibliothèques de transcriptomes. Parmi ceux-ci, le principal est que le séquençage spécifique à un brin peut établir la directionnalité transcriptionnelle des deux brins d'ARN, réduisant ainsi les erreurs lors du processus d'alignement. De plus, le séquençage de la bibliothèque de lncARN fournit des informations plus riches. La construction d'une bibliothèque de lncARN est réalisée dans le cadre de l'ARNm + lncARN, de sorte qu'un seul cycle de construction de bibliothèque entraîne simultanément des données concernant les deux. ARNm et lncARNs.

Le flux de travail du séquençage des LncRNA

Un typique séquençage de l'lncRNA inclut l'évaluation de la qualité de l'ARN total, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. De l'échantillon d'ARN aux données finales, chaque étape a un impact sur la qualité et la quantité des données. Par conséquent, obtenir des données de haute qualité est la condition préalable pour garantir une analyse complète et crédible des informations biologiques.

Figure 1. Vue d'ensemble du séquençage des lncRNA.

Détection de l'ARN total : Il comprend principalement l'analyse du degré de dégradation de l'ARN et de contamination, la détection de la pureté de l'ARN (rapport OD260/280), la quantification précise de la concentration d'ARN (Qubit) et la détection de l'intégrité de l'ARN.

Construction de bibliothèque : Après que l'ARN total a été qualifié pour la préparation de la bibliothèque, la méthode basée sur le poly-A ARNm L'enrichissement suivi de la fragmentation de l'ARNm est effectué pour réduire les lectures d'ARNr. Ensuite, l'ADNc est synthétisé à partir de l'ARN enrichi et fragmenté en utilisant la transcriptase inverse (Super-Script II) et des amorces aléatoires. Les fragments d'ADNc sont ensuite convertis en ADN double brin à l'aide de la solution tampon, des dNTP (dUTP, dATP, dGTP et dCTP) et de la polymérase. Les fragments d'ADNc sont réparés à l'extrémité et ligaturés à des adaptateurs spécifiques à la plateforme.

La principale différence entre séquençage de lncRNA et conventionnel séquençage du transcriptome la construction de bibliothèques repose sur la méthode d'enrichissement de l'ARN cible. La première utilise un processus de sélection négative pour éliminer l'ARNr, tandis que la seconde utilise une sélection positive pour enrichir principalement ARNm avec des étapes suivantes identiques. Après qualification de l'échantillon, la construction de la bibliothèque est initiée. L'ARN total (>200) est extrait des échantillons de tissu et l'ARNr est éliminé de l'échantillon à l'aide d'un kit de réactifs. Après fragmentation, des amorces aléatoires et une transcriptase inverse sont utilisées pour synthétiser le premier brin d'ADNc, suivi de la synthèse du deuxième brin d'ADNc. L'ADNc double brin purifié subit une réparation des extrémités, une addition d'adénylate et une ligature d'adaptateurs de séquençage. Enfin, des bibliothèques d'ADNc sont obtenues par amplification PCR.

Figure 2. Illustration de la construction de la bibliothèque lncRNA-seq.

Détection et séquençage de bibliothèquesAprès la construction de la bibliothèque, une quantification initiale et une dilution sont effectuées, puis la taille des fragments de la bibliothèque est testée. Pour déterminer la qualité de la bibliothèque, nous pouvons principalement examiner l'état de dégradation de l'ARNm et la taille des fragments insérés. Si une dégradation de l'ARNm se produit, les séquences qui ont été dégradées montreront peu, voire aucune, alignement de lecture. Plus le degré de randomisation est élevé, plus le ARNm fragmentation, plus la couverture des lectures est uniforme dans chaque zone. Le séquençage Hiseq/Miseq est effectué après l'inspection de la bibliothèque.

Analyse des données de séquençage de LncRNA

Le processus d'analyse pour séquençage de lncRNA, par rapport au séquençage du transcriptome, incarne une distinction significative : la nécessité de faire la différence entre l'ARNm et l'ARNlnc. La différence fondamentale entre l'ARNm et l'ARNlnc est la nature non codante de l'ARNlnc. En fonction de leur potentiel de codage, une distinction peut être faite entre ARNm et lncRNA. À l'heure actuelle, même pour les espèces modèles, les entrées lncRNA dans les génomes de référence ne sont pas exhaustivement complètes. Par conséquent, lors de l'analyse, il est souvent nécessaire d'assembler ou de prédire de nouveaux transcrits (ceux qui ne sont pas inclus dans le génome de référence). Par la suite, ces transcrits nouvellement assemblés doivent être évalués pour leur potentiel de codage afin d'obtenir les données de séquence et d'expression des lncRNA nouvellement prédits. séquençage de lncRNA peut analyser l'expression et les informations différentielles de l'ARNm, l'expression et les informations différentielles des lncARN connus (inclus dans le génome de référence) et des lncARN nouvellement prédites, ainsi que les relations réglementaires possibles entre les lncARN et les ARNm. Les analyses qui peuvent être réalisées dans des conditions ordinaires séquençage du transcriptome peut également être mis en œuvre dans séquençage de lncRNA.

L'analyse des données et l'identification des lncARN sont présentées comme suit :

Figure 3. Vue d'ensemble de l'analyse des données et identification des lncARN.

(1) Prétraitement des données

• Évaluation de la qualité. Après avoir obtenu les données brutes (fichiers fastq), la qualité des lectures originales, y compris la distribution du taux d'erreur de séquençage et la distribution du contenu en GC, est évaluée à l'aide de FastQC v0.11.3.
• Filtrage des données. Les séquences de séquençage originales contiennent des lectures de faible qualité et des séquences d'adaptateurs. Pour garantir la qualité de l'analyse des données, les lectures brutes doivent être filtrées pour obtenir des lectures propres, et l'analyse ultérieure est basée sur des lectures propres. Le filtrage des données comprend principalement la suppression des séquences d'adaptateurs dans les lectures, la suppression des lectures avec une proportion élevée de N (N désignant les informations de base non déterminées) et la suppression des lectures de faible qualité. Ce processus est réalisé à l'aide de Cutadapt et Trimmomatic.

(2) Évaluation globale de la qualité de l'ARN-seq. Il comprend principalement l'évaluation de la corrélation inter-échantillons (coefficient de corrélation de Pearson) et l'évaluation de la distribution uniforme.

(3) Alignement des lectures au génome de référence. L'aligner STAR et Tophat 2 sont souvent utilisés pour l'alignement des lectures. Si le génome de référence est correctement sélectionné et qu'il n'y a pas de contamination dans les expériences, les résultats de l'alignement (nombre total de lectures ou fragments alignés) seraient normalement supérieurs à 70 %.

(4) Exploration des données. Après le tri des fichiers, DESeq2 est utilisé pour l'exploration des données. Les résultats de sortie peuvent être utilisés pour l'analyse de clusters et l'analyse en ACP (analyse en composantes principales) parmi les échantillons de RNA-seq, et la relation entre les échantillons peut être explorée ou le plan expérimental peut être vérifié. Plus la distance de regroupement des échantillons ou la distance PCA est proche, plus les échantillons sont similaires.

Assemblage des transcriptions. Les transcriptions sont assemblées avec les logiciels Cufflinks ou Scripture. Cufflinks utilise un modèle de probabilité pour assembler et quantifier le niveau d'expression de l'ensemble des isoformes aussi petit que possible en même temps, afin de fournir l'explication de vraisemblance maximale des données d'expression au point de cartographie, et de fournir les informations de chaîne avec précision grâce à des paramètres spécifiques pour la bibliothèque spécifique à la chaîne. Scripture, qui est basé sur un modèle de segmentation statistique pour distinguer entre les sites d'expression et le bruit de fond expérimental, fournit des informations sur tous les isoformes avec une expression statistiquement significative au site de cartographie, et est applicable à l'assemblage de longues transcriptions.

(6) Dépistage des lncRNA candidats

• Dépistage de base. Le dépistage de base se compose de trois étapes : les transcrits dont la longueur est supérieure à 200 pb et dont le nombre d'exons est supérieur à 2 sont sélectionnés en premier ; ensuite, la couverture de chaque transcrit est calculée par Cufflinks, et les transcrits avec une couverture minimale de lectures supérieure à 3 sont sélectionnés ; enfin, les non-lncRNAs sont filtrés par comparaison avec des non- connus.lncARN non codantet les résultats de Cuffmerge sont utilisés pour le dépistage des positions (un code de classe différent est sélectionné pour différents types de lncRNA).
• Évaluation du potentiel en programmation. Le potentiel de codage est le facteur clé à évaluer. lncARN. Actuellement, les méthodes principales d'encodage de l'analyse du potentiel incluent l'analyse du Calculateur de Potentiel d'Encodage (CPC), l'analyse de l'Indice Codant-Non Codant (CNCI), l'analyse des domaines protéiques PFAM et l'analyse PhyloCSF.

Analyse d'expression. Cela inclut principalement la comparaison des niveaux d'expression, l'analyse de l'expression différentielle, le dépistage des lncRNA différentiellement exprimés, l'analyse des clusters d'expression des lncRNA et l'analyse spécifique des tissus ou des phénotypes. Ces analyses sont généralement réalisées à l'aide de DESeq ou Cuffdiff.

(8) Analyse avancée

• LncARN (longues ARN non codants) prédiction de gènes cibles. La fonction de l'lncRNA est liée au gène de protéine codante adjacent. Les gènes de protéines codantes adjacents à l'lncRNA sont identifiés pour une analyse d'enrichissement fonctionnel, et la fonction principale de l'lncRNA pourrait être prédite dans l'lncRNATargets.
• Analyse d'enrichissement fonctionnel de lncRNA spécifiques. L'lncRNA spécifique fait généralement référence à l'lncRNA avec une expression différentielle ou une expression spécifique aux tissus ou aux phénotypes. L'analyse d'enrichissement fonctionnel de ces lncRNAs spécifiques peut être réalisée respectivement par GO et KEEG.
• Analyse d'interaction. LncARN et ARNm peut être lié par la relation de ciblage, et l'ARNm peut être lié par la protéine, formant ainsi le réseau d'interaction lncRNA-ARNm-protéine. Cette interaction peut être visualisée par Cytoscape.

En utilisant l'étude de Wei et al. intitulée "L'analyse de séquençage des ARN non codants de longue chaîne révèle les profils moléculaires des cellules épithéliales mammaires induites chimiquement", nous allons expliciter l'analyse des données de Séquençage de l'lncRNA.

Identification des transcrits lncRNA :

Analyse du potentiel de codage à l'aide de divers outils logiciels tels que CNCI, CPC, Pfam-scan et CPAT. Les transcrits non codants identifiés par ces outils ont été comptés, et les transcrits communs et uniques de chaque méthode ont été visualisés à l'aide de diagrammes de Venn. L'intersection des résultats prédits a été considérée pour l'analyse ultérieure comme l'ensemble de données pour de nouveaux lncRNA.

Figure 4. Identification des transcrits de lncRNA.

Structure et caractérisation des lncARN :

À travers analyse bioinformatique, on peut comparer des aspects de lncARNs et les ARN messagers (ARNm) tels que leur longueur de transcript, le nombre d'exons et leurs niveaux d'expression respectifs. Les résultats peuvent révéler la zone concentrée des longueurs de lncRNA, la quantité d'exons dans les lncRNA, ainsi que fournir une mesure comparative des volumes d'expression globaux entre les ARNm et les lncRNA.

Figure 5. Analyse comparative des caractéristiques structurelles de l'lncRNA et de l'ARNm.

Analyse de l'expression différentielle des lncARNs :

DESeq a été utilisé pour l'analyse de l'expression différentielle en utilisant les critères de |log2Fold Change|≥2 et p < 0,05. Les lncRNAs identifiés comme étant significativement exprimés différemment comprenaient à la fois des transcrits connus et nouveaux. Des cartes thermiques ont été générées pour visualiser les motifs d'expression des gènes exprimés différemment. lncARNs entre les groupes.

Figure 6. Analyse des lncRNA différemment exprimés.

Prédiction des mRNA ciblés par des lncRNA différemment exprimés :

Prédiction des gènes cibles de DE lncARNs utilisant à la fois des méthodes d'analyse des cibles cis et trans. Identification de gènes cibles communs parmi plusieurs différences significatives. lncARNsVisualisation par carte thermique des gènes cibles exprimés différemment entre les groupes expérimentaux.

Figure 7. Carte thermique des gènes cibles exprimés différemment.

Validation de l'expression des lncARN et des gènes cibles par RT-PCR :

Six lncRNAs DE et quatre gènes cibles candidats ont été sélectionnés pour validation par RT-qPCR. Les niveaux d'expression des gènes sélectionnés lncARNs et les gènes cibles ont été mesurés dans des fibroblastes de chèvre et des cellules épithéliales mammaires induites. Les résultats de RT-qPCR étaient cohérents avec les tendances d'expression observées dans les données de séquençage du transcriptome, confirmant l'exactitude des résultats de séquençage.

Figure 8. Comparaison des résultats de l'analyse lncRNA-seq et RT-qPCR des lncRNAs DE et des gènes cibles dans le groupe CK par rapport au groupe 5i8d.

Analyse d'annotation fonctionnelle des gènes cibles : GO et KEGG :

Les résultats de l'Ontologie Génétique (GO) sont divisés en trois catégories : Processus Biologique (BP), Composant Cellulaire (CC) et Fonction Moléculaire (MF). Grâce aux analyses d'enrichissement GO, il a été révélé que ces gènes cibles jouent des rôles dynamiques dans la régulation d'une multitude de processus biologiques, y compris la modulation des processus métaboliques, la synthèse des protéines, la liaison aux récepteurs et la régulation de l'activité de la tyrosine kinase. L'analyse d'enrichissement provenant de l'Encyclopédie de Kyoto des Gènes et Génomes (KEGG) a fourni des informations supplémentaires, aidant à comprendre les voies biologiques et les réseaux de transduction de signaux dans lesquels ces gènes cibles sont impliqués.

Figure 9. Analyse d'annotation fonctionnelle des gènes cibles.

Réseau d'interaction des lncRNA et mRNA :

De plus, en fonction de l'expression différentielle reconnue des gènes lncRNA et mRNA, ainsi que des gènes cibles cis et trans prédits de lncARN non codantOn pourrait construire une analyse de réseau régulatoire pour dépeindre l'interaction complexe entre les lncARNs exprimés de manière différentielle et leurs gènes cibles respectifs.

Figure 10. Le réseau de régulation des lncARN différentiellement exprimés et des gènes cibles.

L'avantage du séquençage des LncRNA

Optimisation de la bibliothèque : En utilisant des méthodes de déplétion de l'ARN ribosomal et de construction de bibliothèques spécifiques à un brin, notre approche préserve l'intégrité des deux. lncARN non codant et les séquences d'ARNm, ainsi que leurs informations directionnelles.

Séquençage complet : Presque toutes les séquences de lncRNA et d'ARNm dans les échantillons ont été identifiées et analysées, garantissant une couverture complète.

Haute sensibilité et résolution : En tirant parti de la technologie de séquençage à haut débit, le séquençage des LncRNA permet la détection et la quantification des gènes faiblement exprimés. LncARNs avec une sensibilité et une résolution remarquables.

Diversité des espèces : Nous avons réalisé l'identification et l'analyse des lncARNs à travers une large gamme d'espèces, englobant les humains, les animaux et les plantes, soulignant la diversité du champ taxonomique de notre enquête.

Dynamisme : Séquençage de l'lncRNA sert d'outil puissant pour étudier les motifs d'expression dynamique des lncARN, englobant les changements à travers différents stades de développement, tissus et états physiologiques. Cela élucide les mécanismes régulateurs spatiotemporels de lncARNs dans divers processus biologiques.

Analyse rigoureuse : Notre approche a impliqué une curation méticuleuse des bases de données de lncRNA pour l'identification des lncRNA connus et la mise en œuvre de critères de filtrage stricts pour découvrir de nouveaux lncRNA, garantissant la précision et la fiabilité de notre analyse.

Corrélations complètes : Engagez-vous dans une opération approfondie en associant lncRNA avec mRNA, en explorant plus en profondeur les réseaux régulatoires gouvernés par lncRNA.

Variabilité individuelle : séquençage de l'lncRNA peut révéler des différences dans l'expression des lncRNA entre les individus, aidant à comprendre les variations dans l'expression spécifique à chaque individu des lncRNA et leur rôle dans des maladies propres à certains individus.

Point de départ pour la recherche fonctionnelle : Les expressions de lncRNA discrepantes peuvent être filtrées. séquençage de l'lncRNACette information sert de pivot principal pour les efforts de recherche, explorant davantage leur fonction et leurs mécanismes de régulation au sein des processus biologiques.

Application du séquençage des LncRNA

L'application de longueur complète séquençage de l'lncRNA La technologie a relié les types de cellules à leur destin, leur état et leur fonctionnalité. Cela a accéléré les développements dans des domaines tels que la biologie du développement, l'oncologie, les neurosciences, l'immunologie-infection et la toxicologie environnementale.

Explorer les mécanismes moléculaires de lncARNs dans le développement et la croissance. Par exemple, Li et al. ont découvert un nouvel lncRNA trans-agissant régulé par la marque épigénétique d'acétylation de l'histone H3 sur la lysine 4 du gène ACTG1. Ces résultats établissent la base théorique pour de futures analyses fonctionnelles en amont et en aval des lincRNAs dans les Brassicacées. De plus, Yu et al. ont trouvé qu'en condition de forte intensité lumineuse, l'lncRNA de pomme MdLNC610 est impliqué dans l'accumulation des anthocyanines de la peau de pomme en activant la biosynthèse de l'éthylène. Ces découvertes de pointe démontrent les rôles essentiels des lncRNAs dans la croissance et le développement des plantes.

La construction d'atlas de lncRNA de pleine longueur à travers différentes espèces/tissus/maladies permet de déterminer lncARN non codant des modèles d'expression au sein des lignées phylogénétiques. Par exemple, Kyle Palos et ses collègues ont construit une base de données de longs ARN non codants intergéniques (lincARN) de quatre espèces de Brassicaceae en assemblant de nombreuses bases de données de lincARN, ainsi que des techniques de séquençage d'ARN à lecture courte et à lecture longue. Non seulement ils ont pu confirmer les séquences conservées des lincARN de pleine longueur, mais ils ont également établi leurs éléments fonctionnels, tels que les sORF, les régions structurelles et les séquences d'interaction avec les miARN, posant ainsi les bases théoriques pour une analyse plus approfondie des fonctionnalités en amont et en aval des lncARN dans la famille des Brassicaceae.

Figure 11. Identification et caractéristiques de base des lincARN dans quatre plantes crucifères. (Palos et al., 2022)

Dans le domaine de l'oncologie, l'analyse du découpage anormal des gènes dans les cellules tumorales et les échantillons du microenvironnement ainsi que l'examen des éléments clés. lncARN non codant les participants et les régulateurs du processus d'épissage peuvent aider à déchiffrer les mécanismes moléculaires des lncRNA dans la progression tumorale. Cela pourrait également aider au développement de marqueurs moléculaires diagnostiques précoces des tumeurs. Par exemple, Lan et al. ont découvert que lncARN non codant SNHG6 peut induire hnRNPA1 à épisser spécifiquement l'ARNm PKM, augmentant ainsi le ratio PKM2/PKM1, améliorant la glycolyse aérobie dans les cellules du cancer colorectal, et favorisant ainsi la carcinogenèse.

Figure 12. L'expression des protéines hnRNP est positivement corrélée avec l'expression de SNHG6 dans le cancer colorectal. (Lan et al., 2020)

L'étude des réponses des cellules immunitaires de l'hôte, révélant la régulation fonctionnelle de longs ARN non codants (lncARN) impliqués dans les réponses immunitaires de l'hôte, sont d'une importance capitale. Des recherches récentes montrent que le facteur de transcription FUBP3 peut servir de protéine liant l'ARN, interagissant de manière synergique avec l'lncRNA EST12 pour supprimer l'expression de cytokines telles que l'Interleukine (IL)-1β et l'IL-6, favorisant ainsi la prolifération de Mycobacterium tuberculosis (MTB). Il a été observé que l'infection par la souche standard de MTB H37Rv entraîne une régulation à la baisse de l'expression de l'lncRNA GAS5 dans les macrophages, et en ciblant le miR-18a-5p, il y a une amélioration conséquente de la vitalité des macrophages. Parallèlement, les niveaux d'expression des lncRNAs NORAD et SNHG16 augmentent après l'infection. Ces lncARNs régulent négativement leurs gènes cibles respectifs miR-618 et miR-140-5p, exerçant un contrôle sur la prolifération des macrophages et les réponses inflammatoires, influençant ainsi l'issue de l'infection par le MTB.

la recherche explore les modifications de l'expression des ARN non codants longs (lncARN) au niveau cellulaire sous le stress de divers types de polluants environnementaux. Ces polluants comprennent les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les biphényles polychlorés, les éthers diphényliques polybromés, le benzène, les composés de bisphénol, les substances alkyles per- et polyfluorées, les produits pharmaceutiques et de soins personnels, les pesticides, les métaux lourds, les nanomatériaux et les particules PM2,5. L'objectif est de déchiffrer les problèmes à l'intersection de la toxicologie environnementale et de révéler les mécanismes moléculaires par lesquels lncARNs contribue aux effets de toxicité des contaminants environnementaux. Cao et al. ont sélectionné plusieurs lncARN bien étudiés, notamment Birc6-AS2, Mettl3, Malat1, Stedlb1a et Oip5-AS comme cibles de référence. Ils ont exposé des embryons de poisson-zèbre à des solutions de chlorure de mercure, de méthylmercure, de chlorure de plomb, de chlorure de cadmium et d'acide chromique. Ils ont constaté une expression différentielle de lncARN Malat1 sous l'exposition au chlorure de mercure et au méthylmercure. Parallèlement, le groupe d'embryons de poisson-zèbre exposé au mercure a présenté des troubles neurocomportementaux notables, indiquant que l'induction spécifique au mercure de lncARN non codant est impliqué dans les effets neurotoxiques du mercure.

Si vous êtes intéressé par notre séquençage de l'lncRNA service, n'hésitez pas à contacter nos scientifiques. De plus, nous proposons un ensemble de séquençage de transcriptomique services impliquant RNA-seq, séquençage des petits ARN, séquençage de circRNA, séquençage du dégradome, et séquençage de l'ARN bactérien.

Références :

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