Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage d'ARN à cellule unique
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Questions générales
- Quelles sont les caractéristiques de l'ARN étiqueté à cellule unique de 10X Genomics ?
- Les étiquettes de cellules uniques 10X Genomics ARN avec une queue A (le primer de transcription inverse 10X est un oligodT), y compris l'ARNm étiqueté et l'ARNlnc.
- Puis-je effectuer un séquençage de circRNA par séquençage unicellulaire 10X Genomics ?
- Les cellules uniques 10X Genomics ne peuvent pas marquer les circARN, donc vous ne pouvez pas faire de circARN à partir de cellules uniques 10X.
- Comment obtenir des gènes marqueurs dans le séquençage de transcriptome unicellulaire ?
- 1) cellmarker : incluant 13 605 gènes marqueurs pour 467 types cellulaires provenant de 158 groupes (sous-tissus) chez l'humain, et 9 148 gènes marqueurs pour 389 types cellulaires provenant de 81 tissus (sous-tissus) chez la souris.
2) revue de la littérature
3) spéculation sur l'expression génique régulée à la hausse dans une sous-population
4) gènes homologues d'espèces étroitement apparentées
5) La propre base de données de séquençage unicellulaire de CD Genomics
- 1) cellmarker : incluant 13 605 gènes marqueurs pour 467 types cellulaires provenant de 158 groupes (sous-tissus) chez l'humain, et 9 148 gènes marqueurs pour 389 types cellulaires provenant de 81 tissus (sous-tissus) chez la souris.
- Quels projets de séquençage du transcriptome unicellulaire avez-vous réalisés ?
- Nous avons aidé divers clients avec leurs projets, des études sur l'hétérogénéité cellulaire, le développement et la différenciation, la réponse immunitaire, la découverte de nouvelles cellules, des études au niveau cellulaire sur l'édition ciblée des gènes, la typologie des maladies, la construction d'atlas cellulaires, etc.
- Quelle est la différence entre la capture à l'extrémité 5' et à l'extrémité 3' pour la construction de bibliothèques de séquençage à cellule unique ?
- Il existe deux méthodes principales pour le séquençage du transcriptome unicellulaire de 10x Genomics : la construction de bibliothèques à l'extrémité 5' et à l'extrémité 3'. Pour la construction de bibliothèques à l'extrémité 3', la séquence terminale des billes de gel est poly(dT), qui est utilisée pour le couplage complémentaire avec la structure polyA à l'extrémité 3' du transcriptome. En revanche, dans la construction de bibliothèques à l'extrémité 5', les séquences terminales des billes de gel sont des séquences d'oligo switch avec des structures polyG à l'extrémité. Le transcript ajoutera la structure de polyC à son extrémité 5' par l'action d'une enzyme, complétant ainsi le couplage.
- Pourquoi la méthode de capture de l'extrémité 5' est-elle généralement utilisée pour le VDJ ?
- La méthode de capture pour la construction de la bibliothèque VDJ est fixée par la méthode de capture à l'extrémité 5', afin d'enrichir la région variable VDJ à l'extrémité 5' tout en maintenant une longueur de séquence courte, plutôt que la région C plus conservatrice à l'extrémité 3', qui n'est généralement pas l'objet de recherche.
- Quelles analyses d'association peuvent être réalisées pour le séquençage du transcriptome à cellule unique et le séquençage ATAC à cellule unique ?
- 1) Association des sous-populations, cartographiant directement les sous-populations de transcriptomes aux sous-populations cellulaires ATAC.
2) Association des régions génomiques ouvertes et de l'expression génique en aval.
3) L'association de la relation temporelle des régions ouvertes et de la relation temporelle de l'expression génique.
- 1) Association des sous-populations, cartographiant directement les sous-populations de transcriptomes aux sous-populations cellulaires ATAC.
- Comment choisir la profondeur du séquençage RNA à cellule unique ?
- La profondeur du séquençage du transcriptome unicellulaire n'est pas très différente de celle du séquençage du transcriptome normal. Il y a environ 10 à 14 000 espèces d'expression génique dans une seule cellule, mais le nombre total de tous les gènes détectés dans un lot de séquençage unicellulaire dépassera souvent 20 000. Une étude comparant des données de la même cellule à 180 millions de lectures et à 50 millions de lectures a montré un haut degré de concordance. De plus, la profondeur de séquençage détermine la "résolution", et il a été démontré que le séquençage unicellulaire peut distinguer efficacement un groupe de cellules avec des motifs d'expression proches à environ 10.7 lit.
- Combien de cellules peuvent être mesurées à la fois par le séquençage du transcriptome unicellulaire ?
- Le séquençage du transcriptome unicellulaire est équipé d'une puce microfluidique à 8 canaux, qui peut mesurer 8 échantillons en même temps, chaque canal pouvant mesurer entre 100 et 10 000 cellules, une puce pouvant obtenir entre 100 et 80 000 cellules simultanément.
- Quelle est l'efficacité de la capture de transcriptome à cellule unique ? Y aura-t-il plusieurs cellules capturées ?
- Dans des conditions expérimentales normales, l'efficacité de capture des cellules uniques est aussi élevée que 65 % ; la probabilité de capturer plusieurs cellules est extrêmement faible, d'environ 0,9 % pour 1000 cellules.
- Quelle est la quantité typique de données obtenues à partir d'une seule cellule ?
- La recommandation officielle est de 50 000 lectures par cellule. Le nombre de gènes exprimés dans une cellule varie considérablement d'un tissu à l'autre, et la quantité finale de données mesurées devra être analysée au cas par cas.
Pour certains tissus et cellules, cela peut être augmenté à 100 K lectures/cellule ; cependant, une profondeur de séquençage trop élevée peut également apporter plus de bruit et rendre l'analyse des données ultérieure difficile. Lors de l'utilisation de la stratégie de séquençage PE150 (séquençage à double extrémité), si la capture standard est d'environ 8K cellules, la quantité de données de séquençage pour un échantillon est généralement de 120 Gbase/échantillon (8000 x 50K x 150 x 2 / 10).neuf = 120 Gbase).
- La recommandation officielle est de 50 000 lectures par cellule. Le nombre de gènes exprimés dans une cellule varie considérablement d'un tissu à l'autre, et la quantité finale de données mesurées devra être analysée au cas par cas.
- Quels types d'analyses peuvent être effectuées à partir du séquençage d'ARNc?
- Le processus d'analyse standard comprend le contrôle de la qualité des données de séquençage et des statistiques sur divers index (nombre de cellules, nombre de gènes détectés, volume de données mesuré par cellule individuelle, etc.), la quantification de l'expression génique, la classification des types cellulaires, le dépistage des gènes différemment exprimés et l'annotation fonctionnelle, etc. De plus, une analyse personnalisée peut être réalisée en fonction du contexte du projet et de la conception expérimentale.
- Quelles préférences existent dans le séquençage d'ARN à cellule unique ?
- - Préférences d'amplification
- Taux d'abandon : Certains ARNm fortement exprimés ne peuvent pas être amplifiés.
- Éclatement transcriptionnel
- Bruit de fond
- Préférences en raison du cycle cellulaire et de la taille des cellules
- Effet de lot
- - Préférences d'amplification
- Il est important de noter que l'étape de transcription inverse dans le séquençage d'ARNc à cellule unique (scRNA-seq) est cruciale pour convertir l'ARN en ADN complémentaire (ADNc), permettant ainsi l'amplification et le séquençage de l'ARN. Cette étape doit être réalisée avec précision pour éviter les biais et garantir une représentation fidèle des niveaux d'expression génique dans les cellules individuelles.
- L'efficacité de la transcriptase inverse est cruciale.
Les taux de décrochage se situent généralement entre 60 % et 90 %.
3) Les taux d'abandon peuvent varier considérablement entre deux bibliothèques différentes, si les mêmes lignées cellulaires sont traitées avec la même méthode.
- L'efficacité de la transcriptase inverse est cruciale.
- Que rechercher dans les étapes du processus d'amplification en séquençage scRNA ?
- 1) Toute étape d'amplification peut conduire à des préférences.
2) De nombreuses méthodes de séquençage du transcriptome à cellule unique disposent d'une métrique de codes-barres moléculaires pour nous aider à corriger les préférences d'amplification.
3) Les transcriptomes complets tels que SmartSeq2 n'ont pas de codes-barres moléculaires et ne peuvent donc pas être corrigés pour les préférences d'amplification en utilisant la méthode des codes-barres moléculaires.
- 1) Toute étape d'amplification peut conduire à des préférences.
- Quels sont les points de contrôle de qualité dans le séquençage d'ARNc simple ?
- • Taux de jumelage unique
• Proportion de correspondances aux régions exoniques
• Préférence de 3' dans les transcrits complets à cellule unique
• Lectures appariées à l'ARNm
• Rapport des codes-barres/lectures moléculaires
• Nombre de gènes détectés
• Détection de l'ARN Spike-in
• Rapport ARN mitochondrial et ARN ribosomal
- • Taux de jumelage unique
- Quel est le problème s'il y a peu de séquences d'ARN spike-in ?
- S'il y a peu de séquences d'ARN ajoutées, cela peut être une indication directe d'un échec de la construction de la bibliothèque. Si l'ajout est normal, mais que la cellule a peu de séquences d'ARN, cela peut être dû au fait que la cellule elle-même est très petite ou que la cellule est endommagée avant la construction de la bibliothèque.
- Quel est le problème si les résultats du séquençage scRNA montrent une forte présence d'ARN mitochondrial ?
- Si l'ARN mitochondrial est trop élevé, cela indique également qu'il y a une rupture cellulaire. En effet, lorsque la cellule est rompue, l'ARN cytoplasmique s'échappe, mais l'ARN mitochondrial ne se déverse pas car il est enveloppé par la membrane mitochondriale. Par conséquent, lorsqu'il y a une rupture de la membrane cellulaire, le pourcentage d'ARN mitochondrial sera élevé.
- Quel est le problème si un pourcentage élevé d'ARN ribosomal est trouvé dans le résultat de séquençage de l'ARN scRNA ?
- Lorsque le pourcentage d'ARN ribosomique est élevé, cela peut être dû à une grande quantité de dégradation de l'ARN dans la cellule. Dans le transcriptome unicellulaire de pleine longueur, la préférence pour le 3' peut être utilisée pour détecter la présence d'une grande quantité de dégradation de l'ARN dans la cellule.
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Préparation des échantillons
- Que devrais-je faire si j'ai tendance à former des agglomérats lors de la préparation de suspensions cellulaires uniques ?
- 1) Ajoutez quelques gouttes de DNase stérile (1 mg/ml dissous dans l'eau) à la suspension cellulaire pour rompre les brins d'ADN. Soufflez doucement sur les cellules pour éviter d'endommager physiquement la membrane cellulaire.
2) Trouvez le temps approprié pour la digestion enzymatique.
3) Lavez les cellules avec une solution saline équilibrée sans calcium ni magnésium, de l'EDTA peut être ajouté et la concentration peut aller jusqu'à 2 mM.
Il est préférable de ne pas secouer vigoureusement pendant la digestion, afin que les cellules soient particulièrement susceptibles de se détacher de manière floconneuse.
- 1) Ajoutez quelques gouttes de DNase stérile (1 mg/ml dissous dans l'eau) à la suspension cellulaire pour rompre les brins d'ADN. Soufflez doucement sur les cellules pour éviter d'endommager physiquement la membrane cellulaire.
- Comment préparer des échantillons pour le séquençage du transcriptome à cellule unique ?
- Les échantillons utilisés pour le séquençage du transcriptome à cellule unique diffèrent entre les cellules animales et les cellules végétales. Les cellules animales doivent être traitées avec des suspensions de cellules uniques et les cellules végétales doivent être traitées avec des protoplastes. Les échantillons frais nécessitent généralement une viabilité cellulaire de 90 % ou plus, sans la présence d'inhibiteurs de la transcription inverse et de molécules d'acide nucléique non cellulaires.
- Pourquoi la viabilité cellulaire requise après la préparation de la suspension de cellules uniques est-elle si élevée ?
- Parce que l'ARN provenant de cellules mortes sera libéré dans le liquide extracellulaire ou mélangé dans le GEM des cellules vivantes. Cet ARN libre peut être enveloppé par les cellules et affecter la réaction subséquente, ce qui conduit finalement à des résultats d'analyse inexactes. En même temps, le nombre élevé de cellules mortes entraînera également une estimation inexacte du nombre de cellules et affectera le taux de capture.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
