Protocole de Profilage des Ribosomes

Introduction au profilage des ribosomes

Profilage des ribosomes, communément appelé Ribo-Seq, se présente comme une technique puissante utilisée dans l'étude de la traduction, le processus complexe par lequel les ribosomes orchestrent la synthèse des protéines à partir de modèles d'ARNm. Cette méthode de pointe offre un aperçu des positions des ribosomes le long des ARNm, permettant aux scientifiques d'examiner l'état de traduction des ARNm individuels et d'évaluer leur efficacité. Profilage des ribosomes englobe la capture et le séquençage de fragments d'ARNm protégés par des ribosomes. Étiquetés comme empreintes protégées par les ribosomes (RPFs), ces fragments délimitent les emplacements précis des ribosomes sur les ARNm, offrant des informations précieuses sur la dynamique de la traduction. L'objectif principal est de quantifier et de cartographier la présence des ribosomes tout au long de la transcriptome, révélant finalement les gènes en cours de traduction et le rythme auquel ce processus se déroule.

Le protocole détaillé pour Profilage des ribosomes est comme suit :

Profilage des ribosomes Préparation de la bibliothèque

Fractionnement cytosolique

Extraire la fraction cytosolique (volume final de 600 μL), en utilisant le tampon de lyse hypotonique sans inhibiteur d'ARNase. Maintenir à 4 °C dans une chambre froide pour éviter la dégradation indésirable de l'ARNm pendant le processus.

Empreinte RNase I et Récupération des Ribosomes

1. Prenez 600 μL de la fraction cytosolique et ajoutez 7,5 μL de RNase I (100 U/μL).
2. Incubez pendant 45 minutes à température ambiante en mélangeant doucement sur un nutateur.
3. Pour arrêter la digestion par la RNase I, ajoutez 10 μL de SUPERase Inhibitor et tapotez doucement les tubes.
4. Exécutez une solution de saccharose à 15-45 % et confirmez une digestion efficace par l'RNase I.
5. Collectez et combinez les fractions 6, 7 et 8. Les fractions 9-10 incluent des fragments d'ARNm protégés par des disomes qui peuvent représenter un blocage des ribosomes et sont exclus de notre analyse.
6. Ajoutez 4,5 mL de Trizol-LS aux fractions combinées (total de 6 mL) et extrayez l'ARN total.

Purification par gel Footprint

1. Ajoutez 2× le tampon de chargement dénaturant à chaque échantillon.
2. Préparez 1 μL de marqueur d'ARN de 26 nt et de 34 nt et 1 μL d'échelle d'ADN de 10 pb comme contrôle. Ajoutez 4 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) et 5 μL de tampon de chargement dénaturant 2× à chacun.
3. Dénaturez l'échantillon à 80 °C pendant 90 s et transférez l'échantillon directement sur de la glace.
4. Séparez l'échantillon en utilisant un gel de polyacrylamide TBE-Urea à 10 % dans un tampon TBE 0,5× avec une puissance constante (5 W) pendant 80 minutes, jusqu'à ce que le colorant bromophénol bleu atteigne les deux tiers du gel. Rincer chaque puits avec une solution TBE 0,5× à l'aide d'une seringue avant le chargement de l'échantillon aide à générer des bandes bien formées.
5. Démontez soigneusement la cassette de gel et colorez le gel pendant 3 minutes avec 1× SYBR gold dans un tampon TBE à 0,5×.
6. Excluez l'empreinte du ribosome (région de 24 à 36 nt) et le marqueur de 26 nt/34 nt. Les empreintes de 26 nt/34 nt extraites ici servent de contrôle pour les étapes restantes.
7. Extraction de gel par overnight. Ajouter 400 μL de tampon d'extraction de gel d'ARN et congeler l'échantillon pendant 30 minutes sur de la glace carbonique. Laisser l'échantillon reposer toute la nuit (15 h est recommandé) avec un mélange doux. Récupérer toute la solution et transférer dans des eppitubes non collants et sans RNase. Précipiter les empreintes en ajoutant 2 μL de Glycoblue et 500 μL d'isopropanol. Effectuer la précipitation pendant 30 minutes ou plus sur de la glace carbonique. Centrifuger à la vitesse maximale à 4 °C pendant 30 minutes à l'aide d'une centrifugeuse de table. Les empreintes finissent souvent sur les parois des tubes. Si cela se produit, resuspendre les empreintes et centrifuger à nouveau. Éliminer complètement le surnageant et laisser sécher à l'air pendant 5 minutes. Dissoudre les empreintes dans 10 μL d'eau sans RNase.

Déplétion de l'ARNr Ribo-Zero

1. Réalisez la déplétion d'ARNr en utilisant le kit de suppression d'ARNr Ribo-zero en suivant le protocole du fabricant.
2. Concentrez l'échantillon dépourvu d'ARNr selon le protocole du fabricant du kit. À l'étape d'élution finale, utilisez 8 μL d'eau sans RNase, ce qui donnera 7 μL d'élut final.

Déphosphorylation, Ligation de Linker et Purification des Produits Ligués par Linker

1. Réaction de déphosphorylation. Mélangez 7 μL de footprint dépourvu d'ARNr et 1 μL de tampon PNK. Incubez à 75 °C pendant 1 min et refroidissez sur glace. Ajoutez 1 μL d'inhibiteur SUPERase et 1 μL de T4 PNK. Incubez pendant 1 h à 37 °C (volume total : 10 μL). À la fin, inactivez les échantillons par chauffage à 65 °C pendant 3 min et refroidissez les échantillons sur glace.
2. Réaction de ligation de linker. Mélangez 10 μL de produits déphosphorylés et 1 μL de linker-1. Dénaturez l'échantillon pendant 90 s à 80 °C et refroidissez immédiatement sur glace pendant 10 min. Ajoutez 1 μL de tampon T4 Rnl2, 1 μL d'inhibiteur SUPERase, 6 μL de PEG8000 et 1 μL de ligase ARN T4 2 (truncée). Incubez pendant 3 h à 25 °C.
3. Ajoutez 30 μL d'eau sans RNase à chaque échantillon et purifiez le produit ligaturé en utilisant le kit Zymo RNA Clean and Concentrator-5. Notez que le kit élimine efficacement le linker non ligaturé. À l'étape finale, éluez le produit ligaturé dans 11 μL de solution de Tris-HCl à 10 mM (pH 8,0). L'élution finale est de -10 μL.

Transcription inverse et circularisation

1. Ajoutez 2 μL de primer de transcription inverse à 0,25 μM à 10 μL de produit lié par un linker.
2. Dénaturez l'échantillon pendant 2 minutes à 80 °C et refroidissez immédiatement sur glace.
3. Ajoutez 8 μL de mélange maître de transcription inverse à chaque échantillon pour obtenir une réaction de 20 μL.
4. Hydrolyse le modèle d'ARN en ajoutant 2,2 μL de NaOH 1 N et incubez à 90 °C pendant 20 minutes.
5. Précipitez le produit de RT. Ajoutez 20 μL d'acétate de sodium 3 M (pH 5,5), 2 μL de Glycoblue, 156 μL d'eau distillée, 300 μL d'isopropanol et précipitez sur de la glace sèche pendant 30 minutes. Pélletez l'ADN pendant 30 minutes comme décrit et resuspendre le produit de RT dans 10 μL d'eau distillée.
6. Préparez 2 μL de primer RT à 0,25 μM (mélangé avec 3 μL de Tris-HCl 10 nM, pH 8,0 et 5 μL de tampon de chargement dénaturant 2×) et 1 μL d'échelle d'ADN de 10 pb comme contrôle. Ajoutez 10 μL de tampon de chargement 2× à chaque échantillon. Dénaturez l'échantillon à 80 °C pendant 90 s et refroidissez immédiatement sur glace.
7. Séparez l'échantillon en utilisant un gel de polyacrylamide TBE-Urea à 7,5 % dans un tampon TBE 0,5× avec une puissance constante (5 W) pendant 1 h et 30 min jusqu'à ce que le colorant bromophénol bleu atteigne le bout du gel.
8. Excisionnez le produit de transcription inverse et transférez-le dans des tubes Eppendorf non adhésifs. Des tubes de 2 mL sont recommandés pour l'extraction d'ADN. Évitez toute contamination provenant de l'amorce RT non étendue.
9. Extraction de gel par overnight. Ajouter 400 μL de tampon d'extraction de gel d'ADN et congeler l'échantillon pendant 30 minutes sur de la glace sèche. Laisser l'échantillon toute la nuit (15 heures sont recommandées) avec un mélange doux. Collecter l'ensemble de la solution et la transférer dans des tubes RNase-free anti-adhésifs. Précipiter les empreintes en ajoutant 2 μL de Glycoblue et 500 μL d'isopropanol. Réaliser la précipitation pendant 30 minutes ou plus sur de la glace sèche. Centrifuger à la vitesse maximale à 4 °C pendant 30 minutes à l'aide d'une centrifugeuse de table. Éliminer complètement le surnageant et laisser sécher à l'air pendant 5 minutes. Dissoudre l'empreinte dans 15 μL de Tris-HCl à 10 mM (pH 8.0).
10. Mélangez 15 μL de produit extrait de gel, 2 μL de tampon CircLigase, 1 μL d'ATP à 1 mM, 1 μL de MnCl2 à 10 nM et 1 μL de CircLigase par échantillon, incubez la réaction pendant 1 h à 60 °C et inactivez par chaleur pendant 10 min à 80 °C.
11. Récupérez le produit final d'ADN. Ajoutez 74 μL d'eau distillée, 6 μL de NaCl à 5 M, 2 μL de Glycoblue et 150 μL d'isopropanol, puis précipitez l'ADN.
12. Resuspendre le produit d'ADN circulé dans 5 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0).

Génération de bibliothèque indexée

1. Amplification PCR de la bibliothèque circulaire à l'aide de la polymérase Phusion selon les instructions du fabricant. Exécutez plusieurs cycles différents pour comparaison. Utilisez des amorces inverses avec codes-barres différents pour différents échantillons avec une seule amorce directe.
2. Ajoutez 6× le colorant de chargement d'ADN à chaque produit PCR et préparez 1 μL d'échelle d'ADN de 10 pb comme contrôle.
3. Séparez les produits PCR en utilisant un gel de polyacrylamide TBE à 8 %, pendant 90 minutes à 180 V dans un tampon TBE à 0,5×, ou jusqu'à ce que le colorant bromophénol bleu atteigne les deux tiers du gel.
4. Teindre le gel pendant 3 minutes dans une solution de 1× SYBR Gold dans un tampon 0,5× TBE.
5. Excisiez le produit PCR d'environ 175 nt du gel et excluez soigneusement la bande étalée migrante lentement (au-dessus de 200 nt), les bandes de la transcription inverse non étendue (environ 145 nt), ainsi que le modèle et l'amorce (moins de 100 nt).
6. Extraction de gel par overnight. Ajouter 400 μL de tampon d'extraction de gel d'ADN et congeler l'échantillon pendant 30 minutes sur de la glace carbonique. Laisser l'échantillon toute la nuit (15 heures sont recommandées) en mélangeant doucement. Collecter l'ensemble de la solution et la transférer dans des eppitubes non collants et sans RNase. Précipiter les empreintes en ajoutant 2 μL de Glycoblue et 500 μL d'isopropanol. Effectuer la précipitation pendant 30 minutes ou plus sur de la glace carbonique. Centrifuger à la vitesse maximale à 4 °C pendant 30 minutes à l'aide d'une centrifugeuse de paillasse. Éliminer complètement le surnageant et laisser sécher à l'air pendant 5 minutes. Dissoudre l'empreinte dans 15 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0).
7. Mesurez la concentration d'ADN et combinez des quantités égales de chaque échantillon pour le séquençage Illumina.

Séquençage avec les plateformes Illumina

Ce protocole aboutit à une bibliothèque de séquençage pleinement fonctionnelle compatible avec Illumina. HiSeq, MiSeq, et NextSeq plates-formes de séquençage. L'utilisateur doit suivre les procédures standard recommandées par Illumina pour ajuster la concentration finale de la bibliothèque avant de la charger sur un flow-cell Illumina et le séquençage approprié pour le séquenceur utilisé.

Conclusion

Profilage des ribosomes fournit une vue d'ensemble haute résolution et complète de la traduction en cartographiant précisément les emplacements des ribosomes sur les ARN messagers (ARNm). Cette technique sert d'instrument robuste pour analyser quantitativement les motifs d'expression génique, découvrir de nouveaux phénomènes de traduction et examiner la dynamique de la synthèse des protéines. La capacité unique de profilage des ribosomes surveiller la traduction en temps réel, tout en fournissant des informations quantitatives précises sur l'abondance et l'efficacité des ribosomes, en fait un atout essentiel pour les recherches en génomique fonctionnelle, en régulation translationnelle et en modulation de l'expression génique dans diverses circonstances biologiques.

Référence :

1. Jin H Y, Xiao C. Une méthode intégrée de profilage des polysomes et de profilage des ribosomes pour étudier le translatome in vivo // Séquençage de nouvelle génération. Humana Press, New York, NY, 2018 : 1-18.