les miARN est essentiel à la régulation de l'expression génique post-transcriptionnelle, orchestrant divers processus cellulaires fondamentaux au développement des organismes, à l'homéostasie et à la pathogénie des maladies. L'avènement de séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné la recherche sur les miARN, offrant des aperçus sans précédent sur le paysage complexe de l'expression des petits ARN. Une connaissance approfondie de leurs fonctions régulatrices et de leurs motifs d'expression est essentielle pour déchiffrer leurs rôles respectifs dans les états de santé et pathologiques. Le séquençage des miARN, une technique redoutable, facilite un profilage complet de l'expression des miARN, éclairant ainsi leurs implications fonctionnelles. Dans ce discours, nous présentons un aperçu détaillé du flux de travail et du protocole de séquençage des miARN, soulignant chaque étape constitutive du processus.
Comment fonctionne le séquençage des miARN ?
1. Préparation des échantillons
Le processus de séquençage des miARN commence par la préparation des échantillons, au cours de laquelle de l'ARN de haute qualité est extrait des spécimens biologiques pertinents. Diverses sources d'échantillons, allant des tissus, cellules, biofluides aux échantillons environnementaux, sont adaptées à l'analyse de séquençage des miARN. Les méthodologies d'extraction de l'ARN total sont choisies judicieusement pour garantir la préservation des petites espèces d'ARN, les techniques couramment utilisées incluant l'extraction TRIzol ou les kits de purification par colonne. Une attention rigoureuse est accordée à la réduction des risques de dégradation de l'ARN et de contamination tout au long des phases de manipulation et de traitement.
2. Contrôle de la qualité de l'ARN
Après l'extraction de l'ARN, la qualité et la quantité de l'ARN extrait sont évaluées à l'aide de méthodes spectrophotométriques, telles que l'absorbance UV, et de techniques électrophorétiques comme l'électrophorèse sur gel d'agarose. Maintenir l'intégrité de l'ARN est primordial pour un séquençage réussi des miARN, car un ARN dégradé peut compromettre la précision et la robustesse des résultats de séquençage. Par conséquent, des critères stricts sont appliqués pour sélectionner des échantillons d'ARN de haute qualité avec des fractions de petits ARN préservées pour la construction ultérieure de bibliothèques.
3. Préparation de la bibliothèque de petits ARN
La prochaine étape dans le séquençage de miARN Le flux de travail est la génération de bibliothèques de petits ARN. Les molécules de petits ARN, y compris les miARN, sont enrichies à partir du pool total d'ARN en utilisant des méthodes de sélection par taille, telles que l'électrophorèse sur gel ou la chromatographie par exclusion de taille. La fraction de petits ARN enrichie est ensuite ligaturée avec des adaptateurs qui facilitent la transcription inverse et l'amplification. Cette étape introduit des codes-barres ou des index uniques pour chaque échantillon, permettant le séquençage multiplexé de plusieurs échantillons lors d'une seule course de séquençage.
4. Transcription inverse et amplification par PCR
Lors de la ligature, un amorce spécifique aux miARN est utilisée pour convertir les petits ARN adhérés aux adaptateurs en ADN complémentaires (ADNc). À ce stade, une réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour accentuer la bibliothèque d'ADNc et intégrer les suites nécessaires pour le séquençage en aval. Un ajustement minutieux des conditions de PCR est essentiel pour minimiser les biais et réduire la probabilité d'artefacts lors de l'amplification, garantissant ainsi que l'abondance des miARN dans la bibliothèque de séquençage finale corresponde à l'échantillon original.
5. Contrôle de la qualité des bibliothèques
Après l'amplification par PCR, la qualité et la quantité des bibliothèques de petits ARN sont évaluées à l'aide de méthodologies analytiques telles que l'électrophorèse capillaire (par exemple, Agilent Bioanalyzer) ou des techniques fluorométriques (par exemple, fluoromètre Qubit). L'évaluation de la distribution de taille des bibliothèques et de leur concentration est impérative pour s'assurer du respect des critères de séquençage. Par la suite, les bibliothèques qui répondent avec succès aux normes de contrôle de qualité subissent une normalisation et un regroupement en préparation pour le séquençage.
6. Séquençage
Les bibliothèques de petits ARN combinées sont introduites sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération, telle que l'Illumina MiSeq, HiSeq ou NovaSeq, pour subir un séquençage par synthèse. Tout au long de ce processus, des nucléotides marqués par fluorescence sont successivement incorporés dans des brins d'ADN complémentaires, produisant des lectures de séquence qui décrivent fidèlement la composition des petits ARN de l'échantillon. La profondeur de séquençage, quantifiée par le nombre de lectures générées par échantillon, est adaptée pour répondre à la couverture et à la sensibilité souhaitées nécessaires pour une analyse précise de l'expression des miARN.
7. Prétraitement des données et contrôle de la qualité
Après le séquençage, les données brutes produites par le séquenceur subissent un prétraitement pour éliminer les séquences d'adaptateurs, les lectures de faible qualité et les artefacts de séquençage. Les paramètres de contrôle de qualité, tels que la qualité des séquences par base et la distribution du contenu en GC, sont examinés pour maintenir l'intégrité des données. Les procédures de prétraitement peuvent également impliquer l'excision des bases de faible qualité et le tri des lectures selon des critères de longueur et de composition de séquence.
8. Alignement et Cartographie
Les lectures de séquençage prétraitées sont alignées sur des génomes de référence ou des bases de données de séquences de miARN en utilisant des algorithmes d'alignement spécialisés, tels que Bowtie, BWA ou miRDeep2. Dans les cas où les espèces possèdent des génomes bien annotés, les lectures peuvent être directement mappées sur des coordonnées génomiques correspondant à des miARN établis. En revanche, lorsque les génomes de référence sont absents ou incomplets, les lectures peuvent être alignées sur des bases de données de séquences de miARN pour identifier des miARN connus ou utiliser des méthodologies de prédiction de miARN de novo.
9. Quantification de l'expression des miARN
Lors de l'alignement des lectures, les niveaux d'expression des miARN sont quantifiés en comptant le nombre de lectures s'alignant sur chaque séquence de miARN. Pour atténuer les écarts résultant des variations de profondeur de séquençage et de taille de bibliothèque entre les échantillons, des techniques de normalisation telles que les lectures par million (RPM) ou les transcrits par million (TPM) sont utilisées. Les profils d'expression des miARN résultants fournissent des informations quantitatives sur l'abondance des miARN individuels au sein des échantillons.
10. Analyse de l'expression différentielle
Des méthodologies statistiques sont utilisées pour discerner les miARN exprimés de manière différentielle dans des conditions expérimentales ou des cohortes d'échantillons variées. L'analyse de l'expression différentielle implique une évaluation comparative des niveaux d'expression des miARN à travers les échantillons, en tenant compte de manière minutieuse de facteurs tels que les réplicats biologiques et les nuances de conception expérimentale. Les miARN dysrégulés de manière significative sont identifiés grâce à des critères statistiques rigoureux englobant le changement de fold et les p-values ajustées, éclairant ainsi les changements régulatoires médiés par les miARN liés aux processus biologiques ou aux conditions pathologiques.
11. Annotation fonctionnelle et analyse des voies métaboliques
L'expression différentielle des miARN incite à un examen rigoureux pour dévoiler leur signification fonctionnelle au sein des cadres biologiques, englobant les voies cellulaires et les étiologies des maladies. Cette exploration nécessite une approche multifacette, intégrant les profils d'expression des miARN avec des ressources bioinformatiques de pointe et des bases de données. Grâce à cette intégration, nous entreprenons des analyses d'enrichissement de voies, prévoyons des candidats gènes cibles et délimitons des réseaux régulateurs modulés par des schémas d'expression aberrants des miARN. En plongeant dans l'annotation fonctionnelle et les analyses de voies, nous acquérons des connaissances profondes sur les rôles essentiels des altérations de l'expression des miARN, dévoilant ainsi leur implication complexe dans la pathophysiologie des maladies.
12. Validation et validation expérimentale
En conclusion, suite à l'identification de candidats miARN potentiels par analyse de séquençage, une validation rigoureuse s'ensuit par le biais de méthodologies expérimentales telles que la réaction en chaîne par polymérase en temps réel quantitative (qRT-PCR), le Northern blotting ou des essais fonctionnels. Ces procédures de validation servent à corroborer les profils d'expression et les impacts régulateurs des candidats miARN identifiés, consolidant ainsi les résultats dérivés des analyses de séquençage de miARN. Une telle validation expérimentale constitue une pierre angulaire, essentielle pour affirmer la crédibilité et la signification biologique des résultats de séquençage de miARN, tout en fournissant des éclaircissements fonctionnels précieux concernant l'implication des miARN dans des milieux biologiques distincts.
13. Interprétation des données et perspectives biologiques
Les résultats dérivés de l'analyse de séquençage des miARN, en conjonction avec les données de validation expérimentale, font l'objet d'une interprétation minutieuse visant à élucider les fonctions régulatrices complexes des miARN tant dans le bien-être physiologique que dans les états pathologiques. Grâce à une approche intégrative, où les profils d'expression des miARN sont harmonisés avec divers ensembles de données omiques englobant l'expression des ARNm, la protéomique et l'épigénomique, une compréhension holistique des réseaux régulatoires dirigés par les miARN est atteinte, mettant en lumière leur influence profonde sur la dynamique cellulaire et les manifestations des maladies. Cet effort interprétatif favorise non seulement la génération d'hypothèses et incite à la formulation de questions de recherche pertinentes, mais révèle également des cibles thérapeutiques potentielles nécessitant une exploration et un examen plus approfondis.
Flux de travail de séquençage de miARN et analyse des données.
Protocole de séquençage des miARN
Dans cette continuation du flux de travail de séquençage des miARN, nous allons examiner le protocole détaillant les étapes impliquées dans la préparation de la bibliothèque de miARN, le séquençage et l'analyse des données.
Protocole de préparation de bibliothèque de miARN
Matériaux :
Échantillons d'ARN total
Kit de préparation de bibliothèque d'ARN petit (par exemple, Kit de préparation de bibliothèque d'ARN petit pour Illumina)
Eau sans nucléase
Adaptateurs et amorces
Inhibiteur de RNase
Transcriptase inverse
Réactifs de PCR (par exemple, Taq polymérase, dNTPs, tampons de PCR)
Procédure :
Ligation des adaptateurs : Mélangez les échantillons d'ARN avec des adaptateurs ARN 3' et 5' et un tampon de ligation. Incubez le mélange à une température appropriée pour la ligation des adaptateurs.
Transcription inverse : Ajoutez de la transcriptase inverse et un inhibiteur d'ARNase aux échantillons d'ARN ligaturés pour générer de l'ADNc. Incubez le mélange de réaction à une température appropriée pour la transcription inverse.
Amplification par PCR : Amplifiez l'ADNc en utilisant des amorces PCR qui s'attachent aux adaptateurs. Effectuez la PCR dans des conditions optimisées pour amplifier la bibliothèque de petits ARN. Incorporez des séquences de codes-barres pour le multiplexage si désiré.
Nettoyage de la bibliothèque : Purifiez les bibliothèques amplifiées en utilisant des méthodes de sélection de taille (par exemple, électrophorèse sur gel ou purification par billes magnétiques) pour éliminer les adaptateurs non incorporés et les dimères de primers.
Contrôle de qualité de la bibliothèque : Évaluer la qualité et la quantité de la bibliothèque en utilisant des techniques analytiques telles que l'électrophorèse capillaire ou la quantification fluorométrique. Valider la distribution de taille et la concentration de la bibliothèque avant le regroupement pour le séquençage.
Protocole de séquençage
Matériaux :
Bibliothèques de petits ARN
Plateforme de séquençage (par exemple, Illumina MiSeq, HiSeq ou NovaSeq)
Réactifs de séquençage (par exemple, cellules de flux, amorces de séquençage et tampons)
Réactifs d'indexation pour le séquençage multiplexé
Procédure :
Dénaturation de la bibliothèque : Dénaturez de petites bibliothèques d'ARN pour générer des modèles d'ADN simple brin pour la génération de clusters de séquençage.
Génération de clusters : Immobilisez les bibliothèques dénaturées sur la surface de la cellule de flux de séquençage en utilisant l'amplification en pont pour générer des clusters de fragments d'ADN identiques.
Séquençage par synthèse : Effectuer le séquençage par synthèse en utilisant des nucléotides marqués par fluorescence pour générer des lectures de séquence à partir des clusters d'ADN. Surveiller les signaux de fluorescence pour déterminer la séquence des nucléotides incorporés.
Appel de base : Convertir les signaux de fluorescence en appels de bases nucléotidiques à l'aide du logiciel de séquençage fourni par la plateforme de séquençage.
Génération de données : Collecter des données de séquençage brutes, y compris des lectures de séquence et des scores de qualité, à partir du séquenceur pour une analyse ultérieure.
Protocole d'analyse des données
Pipeline de bioinformatique :
Prétraitement : Couper les séquences d'adaptateurs et les bases de faible qualité des lectures de séquençage brutes. Filtrer les courtes lectures (< 15 nucléotides) et les séquences à faible complexité.
Alignement : Mapper les lectures traitées aux génomes de référence ou aux bases de données de séquences de miARN en utilisant des algorithmes d'alignement (par exemple, Bowtie ou BWA).
Quantification : Comptez le nombre de lectures qui s'alignent sur chaque séquence de miARN. Normalisez les comptes de lectures pour corriger les différences de profondeur de séquençage et de taille de bibliothèque.
Analyse d'expression différentielle : Identifiez les miARN exprimés de manière différentielle entre les conditions expérimentales en utilisant des méthodes statistiques (par exemple, DESeq2 ou edgeR).
Annotation fonctionnelle : Annoter fonctionnellement les miARN en fonction de la prédiction des gènes cibles, de l'analyse d'enrichissement des voies et de l'analyse des réseaux de régulation.
Validation : Valider les résultats de séquençage en utilisant des techniques expérimentales telles que le qRT-PCR ou des tests fonctionnels pour confirmer les schémas d'expression et les effets régulateurs des miARN candidats.
Conclusion
Le flux de travail de séquençage des miARN fournit un cadre robuste pour le profilage de l'expression des miARN et l'élucidation de leur signification fonctionnelle dans les processus biologiques et les maladies. En suivant le protocole décrit ci-dessus, les chercheurs peuvent générer des données de séquençage de miARN de haute qualité, analyser des modèles d'expression différentielle et obtenir des informations sur les réseaux régulateurs médiés par les miARN. Cette approche globale facilite la découverte de nouveaux biomarqueurs, cibles thérapeutiques et aperçus mécanistiques de la biologie des miARN, contribuant ainsi aux avancées dans la recherche biomédicale et la médecine de précision.
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Directives de Soumission d'Échantillons
