Les principes et le flux de travail des microarrays SNP

Qu'est-ce qu'un microarray SNP ?

microarray SNP, une technologie de microarray spécialisée, est destinée à la détection des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), caractérisant les variations à une seule paire de bases dans le génome. Émergée ces dernières années, microarray SNP la technologie représente une plateforme de test génétique à haut débit et à grande échelle. Le principe de fonctionnement repose principalement sur l'hybridation de l'ADN simple brin fragmenté avec un réseau comprenant des centaines de milliers de séquences de sondes nucléotidiques uniques.

Le polymorphisme nucléotidique unitaire (SNP) fait référence à la différence d'un seul nucléotide à la même position dans la séquence d'ADN génomique. En général, une variation de nucléotide unique avec une fréquence supérieure à 1 % est appelée un SNP. Les SNP impliquent uniquement une variation d'une seule base, qui peut être causée par une transition ou une transversion d'une seule base. Il y a environ un SNP pour 1000 bases dans le génome humain, et le nombre total de SNP dans le génome humain est d'environ 3 x 10^6.

Les SNP sont devenus la troisième génération de marqueurs génétiques. Les caractéristiques des SNP les rendent plus adaptés aux études sur la pléiotropie génétique dans les traits complexes et les maladies, ainsi qu'à la reconnaissance des gènes basée sur la population, que d'autres marqueurs polymorphes. Les SNP ont une importance significative dans la recherche biomédicale. Les SNP ont été utilisés dans des études d'association à l'échelle du génome en tant que marqueurs haute résolution dans le cartographie des gènes liés aux maladies ou aux traits normaux. Les SNP sans impact observable sur le phénotype (appelées mutations silencieuses) peuvent également être utiles en raison de leur quantité et de leur héritage stable au fil des générations.

Figure 1. La molécule d'ADN supérieure diffère de la molécule d'ADN inférieure à un seul emplacement de paire de bases (un polymorphisme C/A).

L'ADN microarray fait référence à une puce génique contenant un grand nombre de séquences d'ADN sonde disposées dans un arrangement spécifique immobilisé sur un substrat solide. Le principe est basé sur la théorie de l'hybridation des acides nucléiques, et l'ADN de l'échantillon détecté est hybridé avec la microarray d'ADN et étendu. Par la suite, les fragments de la réaction de liaison non complémentaire sur la puce sont éliminés par lavage, et la puce génique est soumise à un balayage confocal laser. Les intensités des signaux de fluorescence sont ensuite mesurées et interprétées comme l'abondance de différents gènes à travers un certain traitement des données.

Principes des microarrays SNP

Le principe fondamental de microarrays SNP implique une stratégie de hybridation unique où les échantillons d'ADN, pour analyse, subissent une hybridation avec des sondes intégrées sur la puce. Le nombre de copies à chaque locus peut ensuite être déterminé en comparant les intensités de signal à travers divers échantillons.

microarrays SNP profiter des différences dans les loci SNP entre les individus. Conventionnellement, la détection des sites SNP est basée sur l'alignement des séquences d'ADN. À l'intérieur microsatellites SNPDes sondes présentant différentes variations de SNP sont utilisées. Ces sondes correspondent spécifiquement aux sites de SNP. Grâce à l'hybridation de l'ADN des échantillons, le génotype de chaque site de SNP peut être déterminé. De plus, la fréquence des différents génotypes peut être évaluée en mesurant l'intensité du signal.

Comparé aux méthodes de diagnostic unicellulaire traditionnelles, microarray SNP sert d'approche à haut débit, capable de réaliser des milliers de réactions simultanément sur la surface de la puce d'oligonucléotides.

Figure 2. Le principe des microarrays.

Flux de travail de la microarray SNP

Le flux de travail général de microarray SNP est montré dans la figure 3. En bref, il y a plusieurs processus : fabrication de la puce SNP, préparation de l'ADN génomique de l'échantillon, hybridation et balayage par fluorescence.

Figure 3. Le flux de travail de la microarray SNP.

Conception de sonde

Le processus implique la collecte d'informations sur les séquences génomiques provenant des localisations cibles des polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP). Les informations sur les SNP connus sont ensuite alignées avec la séquence du génome de référence, ce qui détermine la position et la base variable des sites SNP. En utilisant les informations de séquence autour des sites SNP, un ensemble de sondes spécifiques est conçu. Cela garantit que les sondes s'apparieront sélectivement avec les bases variables aux sites SNP cibles.

Lors de la conception des sondes, des expériences in vitro sont menées pour évaluer la performance d'hybridation des sondes, y compris l'efficacité d'hybridation dans des conditions telles que la température et la concentration en sel. La longueur des sondes est contrôlée, généralement comprise entre 20 et 70 bases, afin d'assurer une hybridation stable et une détection de signal fiable. À l'étape de conception des sondes, la séquence complémentaire inverse de l'emplacement SNP cible est également prise en compte pour faciliter la détection bidirectionnelle des mutations.

Fabrication de puces SNP

Les oligonucléotides ou puces cDNA prédéfinis sont disposés de manière ordonnée et à haute densité sur un support en verre pour créer des microarrays ou des puces centrales. Les méthodes de fabrication de la puce incluent la synthèse in situ guidée par la lumière, la méthode de pulvérisation chimique, la méthode de revêtement par points de contact, la synthèse contrôlée de l'ADN in situ, la méthode d'impression micromécanique sans contact TOPSPOT® et la reproduction par lithographie douce, etc. Un total de 4x10^5 molécules d'ADN différentes peut désormais être placé sur une puce de 1 cm². La technologie Affymetrix GeneChip® permet une haute densité, in situ synthèse d'oligonucléotides, et a été un pionnier dans ce domaine.

Préparation d'ADN génomique échantillon

Dans la préparation d'échantillons d'ADN génomique, une étape initiale consiste à acquérir un matériau d'échantillon approprié. Par la suite, il est impératif d'extraire l'ADN génomique puis de l'amplifier par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Enfin, en utilisant différents colorants fluorescents, les échantillons sont marqués pour une analyse ultérieure.

La concentration et la pureté des échantillons d'ADN sont d'une importance capitale. Celles-ci peuvent être évaluées à l'aide de techniques spectrophotométriques, telles que la colorimétrie, la spectroscopie d'absorption ultraviolette ou des tests utilisant des colorants fluorescents. De telles procédures garantissent que l'ADN extrait est de qualité suffisante et ne présente aucune contamination évidente. De plus, en accord avec les exigences expérimentales, une méthode de marquage appropriée est choisie. Les techniques de marquage couramment mises en œuvre comprennent le marquage par fluorescence, le marquage par biotine, ainsi que le marquage par isotopes radioactifs.

Hybridation et balayage

Passons à l'hybridation et au balayage, l'ADN génomique marqué par fluorescence s'hybride avec le microarray SNP dans des conditions de réaction appropriées. Après lavage, la fluorescence est scannée avec un scanner de fluorescence spécialement conçu. Par la suite, les données sont traitées par analyse d'image informatique et soumises pour une analyse bioinformatique des gènes cibles.

Tout d'abord, l'optimisation des différentes conditions d'hybridation — telles que la température, la concentration en sel et le temps d'hybridation — est d'une importance capitale pour garantir une liaison suffisante de l'ADN avec les sondes. Par la suite, lors de l'élution, les conditions d'élution doivent être soigneusement contrôlées pour s'assurer que seul l'ADN qui se lie à la sonde est retenu sur la puce, évitant ainsi la possibilité que de l'ADN non lié compromette la précision des résultats.

Avantages et limitations des microarrays SNP

Les avantages de ce processus incluent la capacité de détecter simultanément plusieurs sites SNP rapidement, ce qui permet d'obtenir une grande quantité de données SNP en une seule expérience. Cette procédure est applicable dans un large éventail de domaines, tels que la recherche liée au génome, l'analyse du génotype individuel et les études de susceptibilité aux maladies, et elle offre un niveau de précision supérieur dans la détection des variations du nombre de copies par rapport au séquençage de nouvelle génération, y compris le séquençage du génome entier (WGS). Elle possède également une résolution supérieure à hybridation génomique comparative par microarray (aCGH)capable de détecter la perte de nombre de copies hétérozygote neutre, certaines formes de disomie uniparentale et des changements de ploïdie.

Cependant, des limitations existent car cette méthode est contrainte par les informations sur les SNP connus et ne peut pas détecter les mutations SNP inconnues. Les méthodes de marquage peuvent introduire un biais et affecter la précision des résultats. De plus, la gestion de données volumineuses nécessite des méthodes d'analyse et de calcul complexes, et le coût de préparation des puces, des réactifs et de l'équipement est relativement élevé.

Application des microarrays SNP

Les microarrays SNP sont devenus un instrument fréquemment utilisé dans divers domaines, y compris la recherche génomique, la médecine personnalisée, le diagnostic des maladies et le développement de médicaments.

Le génotypage SNP, le processus d'identification des variants génétiques d'un individu, nous permet de déterminer les caractéristiques génétiques d'une personne, y compris les différents allèles à divers loci à travers le génome. De plus, en examinant la distribution de fréquence des loci SNP dans différentes populations ou groupes ethniques, nous pouvons obtenir des informations sur la structure génétique et l'histoire évolutive de ces groupes.

Analyse comparative de microarray SNP Les données entre les patients atteints d'une maladie et les participants témoins en bonne santé peuvent identifier des loci SNP associés à des troubles génétiques, offrant ainsi un aperçu des bases génétiques de la maladie. La technique SNP nous offre des opportunités pour découvrir des corrélations avec des maladies complexes (telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires, les troubles mentaux, etc.) et explorer leurs facteurs de risque génétiques.

Une analyse du profil génétique du patient offre un moyen de prédire sa susceptibilité aux influences environnementales et aux prédispositions aux maladies, fournissant ainsi une base pour la prévention personnalisée des maladies et la gestion de la santé. Elle est utilisée pour détecter les variations structurelles du génome, telles que les SNP et les CNV, révélant la structure et la fonction du génome.

Figure 4. Vue du génome entier à partir d'un SNP-microarray réalisé sur l'échantillon de moelle osseuse diagnostique soumis pour investigation de la LLA. (Berry et al., 2019)

De plus, microsatellites SNP sont largement utilisés dans études d'association à l'échelle du génome (GWAS)En analysant les SNPs à travers de grands échantillons, les chercheurs peuvent identifier des loci SNP liés à des phénotypes ou des maladies spécifiques et explorer leur fondement génétique.

Ces dernières années, des méthodes soutenues par microarrays SNP ont été intégrées dans les diagnostics prénataux. Cela est principalement dû à la capacité de l'analyse des SNP à diagnostiquer des régions d'homozygotie (ROH), des translocations déséquilibrées et d'autres aspects dans le diagnostic des maladies génomiques. Ces techniques présentent des avantages considérables par rapport à l'analyse chromosomique traditionnelle du caryotype, les rendant indispensables en tant que technologies de diagnostic génétique de première ligne dans les contextes cliniques contemporains.

Différence entre les microarrays CGH et SNP

Les technologies des microarrays CGH et des microarrays SNP jouent des rôles essentiels dans l'analyse du génome. Cependant, des différences existent dans leurs principes, applications, avantages et inconvénients.

Principes :

Microarray CGHDéployé pour détecter Variations du nombre de copies (CNC) Dans l'ADN génomique, le principe de la CGH implique de marquer l'ADN de l'échantillon et l'ADN de référence simultanément, suivi de leur hybridation sur la puce. Les variations du nombre de copies dans l'ADN de l'échantillon peuvent être déterminées en contrastant l'intensité du signal entre l'ADN de l'échantillon et l'ADN de référence.

Microarray SNPLe microarray SNP est conçu principalement pour identifier les polymorphismes nucléotidiques simples, c'est-à-dire les variations au niveau des paires de bases uniques dans le génome. Son principe sous-jacent repose sur l'hybridation de l'ADN de l'échantillon avec des sondes SNP sur la puce et la détermination des génotypes à chaque locus SNP par la force du signal de l'hybridation entre la sonde et l'ADN de l'échantillon.

Applications :

Microarray CGHSon application principale est la détection des CNV, tels que la duplication, la suppression ou l'amplification de gènes, et l'identification des variations structurelles chromosomiques. Il est largement utilisé dans la recherche en génomique du cancer et le diagnostic des troubles génétiques.

Microarray SNPUtilisé principalement pour détecter les polymorphismes mononucléotidiques, y compris l'identification des génotypes, l'analyse génomique individuelle, la recherche sur la susceptibilité, l'analyse de la structure génétique des populations, etc. Il a une utilité étendue dans les études d'association à l'échelle du génome (GWAS).

Avantages et inconvénients :

Microarray CGHAvantages : Cela permet la détection simultanée de grandes CNV segments dans le génome avec une large couverture, ce qui est adapté pour découvrir de nouveaux CNV. Inconvénients : Cela n'offre pas de données SNP détaillées, donc incapable de détecter des variations de paires de bases uniques, montrant une capacité relativement faible pour la détection de variations de petits fragments.

Microarray SNPAvantages : Il fournit des données SNP directes, ce qui le rend adapté au génotypage individuel et aux études liées aux maladies, avec une haute résolution et spécificité. Inconvénients : Il ne peut détecter que les emplacements SNP connus, ne fournissant aucune information sur les variations inconnues et la détection directe des CNV.

Chez CD Genomics, nous nous engageons à fournir des services de génotypage SNP fiables, y compris génotypage par séquençage, microarray SNP, Génotypage SNP MassARRAY, Système SNaPshot Multiplex pour le génotypage SNP, et Génotypage SNP TaqMan.

Références :

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