Préparation de bibliothèque d'ARN petit pour le protocole de séquençage de nouvelle génération

Isolement d'ARN

1. Homogénéisez les échantillons de tissu : Broyez 100 mg de tissu dans de l'azote liquide jusqu'à obtenir une poudre fine. Mélangez 1 mL de solution de TRI Reagent® avec la poudre dans un tube à microcentrifuge.
2. Alternativement, homogénéisez des cellules cultivées ou des fluides corporels : Homogénéisez et lysez les cellules directement en ajoutant 1 mL de solution de TRI Reagent® par 5 à 10 × 10⁶ cellules ou par surface de 10 cm² de plaque de culture et pipettez de haut en bas.
3. Incubez le mélange pendant 5 minutes à température ambiante pour permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.
4. Ajoutez 200 μL de chloroforme et mélangez vigoureusement pendant 15 secondes. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes supplémentaires.
5. Centrifugez l'échantillon à 16 000 × g à 4 °C pendant 15 minutes. L'échantillon doit se séparer en une phase aqueuse claire en haut, une interphase blanche au milieu et une phase organique rose au fond du tube. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à microcentrifuge, en veillant à ne pas prélever d'interphase ni de phase organique. Notez le volume de la phase aqueuse transférée.
6. Ajoutez 1 volume d'isopropanol à l'extrait d'ARN aqueux et mélangez soigneusement. Cela peut être incubé à température ambiante pendant 10 minutes ou à -80 °C pendant 30 minutes. Le temps et la température de coprécipitation peuvent varier selon les échantillons et peuvent nécessiter une optimisation pour l'organisme ou le type de tissu en question.
7. Centrifugez l'échantillon à 10 000 × g à 4 °C pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Un culot blanc doit s'être formé au fond du tube : c'est l'ARN.
8. Lavez le culot avec 1 mL d'éthanol à 80 %. Vortexez pour décoller le culot et centrifugez à 7500 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Répétez cette étape une fois.
9. Retirez l'éthanol résiduel et laissez sécher l'ARN à l'air libre pendant 5 à 10 minutes en laissant le tube ouvert. Resuspendez l'ARN dans le volume désiré d'eau sans nucléase et conservez à -80 °C. En cas de difficulté à dissoudre l'ARN, l'eau et l'échantillon d'ARN peuvent être chauffés à 70 °C pendant 5 minutes.
10. Quantifiez la concentration d'ARN à l'aide d'un NanoDrop.

Purification de sRNA

1. Mélangez l'éluté d'ARN avec trois volumes d'éthanol absolu, 0,1 volume d'acétate de sodium (pH 5,0) et 1 μL de glycogène (5 mg/mL) ; et conservez-le à -20 °C ou -80 °C pendant la nuit. Centrifugez les échantillons à 20 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C, lavez le culot d'ARN deux fois avec de l'éthanol à 80 %, laissez sécher l'ARN à l'air pendant 5 minutes et resuspendez-le dans un volume approprié d'eau sans nucléase. Déterminez la concentration d'ARN à l'aide d'un NanoDrop.

Adenylation de l'adaptateur HD 3'

1. L'adenylation de l'adaptateur HD 3' doit être effectuée selon les instructions du fabricant pour le kit d'adenylation d'ADN 5'.
2. Incubez la réaction à 65 °C pendant 1 heure.
3. Incubez le mélange de réaction à 85 °C pendant 5 minutes pour inactiver la ligase d'ARN Mth, puis refroidissez sur glace.
4. Purifiez l'adaptateur adenylé en utilisant le Zymo Oligo Clean and Concentrator selon les instructions du fabricant.
5. Déterminez la concentration de l'adaptateur adenylé par Nanodrop et ajustez-la à une concentration finale de 10 μM. Le poids moléculaire de l'adaptateur HD 3' est de 8015 g/mol.
6. Exécutez l'adaptateur adenylé et non-adenylé sur le même gel de polyacrylamide à 15 %. Pour préparer un gel de polyacrylamide à 15 mL, préparez d'abord une solution de 5 mL de 3,5 mL d'eau sans nucléase et 1,5 mL de TBE 5× dans un tube Falcon de 50 mL. Pesez 6,3 g d'urée et dissolvez-la dans la solution d'eau/TBE à 37-42 °C. Il n'est pas conseillé de chauffer le mélange au micro-ondes car le tube Falcon peut exploser. Ajoutez 5,5 mL de solution d'acrylamide/bis à 40 % (19:1), suivi de 7,5 μL de N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 150 μL de persulfate d'ammonium (APS) à 10 %. Ajustez le volume final à 15 mL avec de l'eau sans nucléase. L'adaptateur adenylé peut être conservé à -80 °C.

Ligation de l'adaptateur HD 3'

1. Décongelez 50 % de PEG 8000 dans un bloc chauffant à 37 °C, puis maintenez à température ambiante pour le reste du protocole.
2. Réglez les blocs chauffants à 26 °C et 70 °C.
3. Mélangez 11,25 μL de l'échantillon d'ARN avec 1 μL d'adaptateur HD 3' pré-adenylé à 10 μM.
4. Dénaturez le mélange d'ARN et d'adaptateur à 70 °C pendant 2 minutes, puis refroidissez sur glace.
5. Ajoutez le mélange de réaction de ligation suivant au mélange d'ARN dénaturé et d'adaptateur.
6. Incubez le mélange de réaction à 26 °C pendant 2 heures.
7. Purifiez la réaction de ligation de l'extrémité 3' en utilisant le Zymo RNA Clean and Concentrator en suivant le protocole fourni par le fabricant. À la dernière étape de la purification du kit, éluez l'ARN dans 12,1 μL d'eau sans nucléase et gardez-le sur glace.

Élimination de l'excès d'adaptateur HD 3'

1. Déadenylatez l'adaptateur HD 3' restant en utilisant la déadenylase de NEB.
2. Incubez le mélange de réaction ci-dessus à 30 °C pendant 30 minutes.
3. Arrêtez la réaction en ajoutant 4 μL de EDTA à 25 mM et placez immédiatement le tube sur glace.
4. Ajoutez 2 μL de Tris–HCl à 0,5 M (pH 9,0), 7 μL de MgCl₂ à 50 mM et 1 μL d'exonucléase RecJ dans le tube. Mélangez bien.
5. Incubez la réaction d'exonucléase à 37 °C pendant 30 minutes.

Ligation de l'adaptateur HD 5'

1. Dénaturez 1 μL d'adaptateur HD 5' à 20 μM à 70 °C pendant 2 minutes et refroidissez-le sur glace.
2. Ajoutez l'adaptateur HD 5' dénaturé au mélange de réaction d'exonucléase.
3. Ajoutez les réactifs dans le tube de manière séquentielle et mélangez par pipetage.
4. Incubez la réaction de ligation 5' à 26 °C pendant 2 heures.
5. Purifiez la réaction de ligation 5' en utilisant le kit RNA Clean and Concentrator selon les instructions du fabricant ; à la dernière étape, éluez le mélange de ligation dans 30 μL d'eau sans nucléase et placez la réaction sur glace.

Synthèse et amplification de cDNA

1. Mettez en place la réaction de synthèse de cDNA suivante et mélangez soigneusement. Incubez à 37 °C pendant 20 minutes.
2. Inactivez la réaction en incubant pendant 15 minutes à 85 °C, puis refroidissez sur glace. Le cDNA généré à partir de cette étape peut être conservé à -20 °C ou -80 °C indéfiniment.
3. Mettez en place le mélange de réaction PCR suivant pour amplifier la bibliothèque de cDNA.
4. Exécutez la réaction PCR dans les conditions suivantes. Les produits finaux peuvent être conservés à -20 °C indéfiniment.

Électrophorèse sur gel et extraction des produits PCR

1. Exécutez les produits PCR sur un gel de polyacrylamide natif à 8 % et chargez une échelle d'ADN de 20 pb pour déterminer la taille. Nous avons utilisé le système Mini-PROTEAN III pour l'électrophorèse.
2. Exécutez le gel à 120 V pendant 1,5 à 2 heures dans du TBE à 0,5×.
3. Teignez le gel avec SYBR® Gold et visualisez-le sur un scanner ou une boîte UV.
4. Découpez les bandes d'ADN autour de 145 à 150 pb avec un rasoir stérile : cela contient la bibliothèque de cDNA de sRNAs.
5. Placez le gel dans un « tube briseur de gel » et centrifugez à 20 000 × g pendant 5 minutes. Nous fabriquons ces tubes en perforant la base d'un tube Eppendorf de 0,5 mL avec une aiguille BD Microlance 3 de 0,8 mm × 16 mm.
6. Éluez la bibliothèque de cDNA dans un tampon d'enzyme de restriction NEB 1× en secouant la boue de gel pendant la nuit à 4 °C.
7. Ajoutez la boue de gel dans une colonne Spin-X non stérile de 45 μm et centrifugez à 650 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour éliminer les débris de gel. Il est utile de couper d'abord l'extrémité de la pipette pour élargir l'ouverture avant de charger dans la colonne.
8. Concentrez la bibliothèque de cDNA élue par précipitation d'éthanol pendant la nuit à -80 °C en utilisant les ratios suivants : Pour 300 μL d'éluté, ajoutez 2 μL de GlycoBlue (5 mg/mL), 30 μL de NaOAc à 3 et 975 μL d'éthanol absolu. Laissez le mélange à -20 °C ou -80 °C pendant la nuit.
9. Centrifugez à 20 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C.
10. Retirez le surnageant et lavez le culot avec de l'éthanol à 80 %.
11. Laissez sécher à l'air pendant 5 à 10 minutes et resuspendez dans 12 μL d'eau sans nucléase.
12. Exécutez le produit sur un second gel de polyacrylamide à 8 % et répétez les étapes 1 à 11 de cette section pour éliminer tout autre produit de taille indésirable.
13. Envoyez la bibliothèque de cDNA pour séquençage. Pour les bibliothèques de sRNA, nous séquençons généralement à une profondeur standard de 20 millions de lectures par échantillon.