Déplétion de l'ARN ribosomal pour un protocole de séquençage d'ARN massivement parallèle

Préparation de l'ARN total

Effectuez un traitement à la DNase de l'ARN total pour éliminer la contamination par l'ADN. L'ARN total est isolé à l'aide d'un kit d'ARN ou du réactif TRIzol®. Resuspendez l'ARN total isolé dans de l'eau traitée par DEPC en conséquence. Vérifiez la qualité de l'ARN total.

Étape de hybridation

1. Réglez un bain-marie ou un bloc chauffant à 70-75°C.
2. Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL stérile et sans RNase, ajoutez de l'ARN total (0,5-10 mg) dans moins de 10 mL, 8 mL de jeux de sondes bactériennes 16S et 23S (12,5 pmol/mL), et 100 mL de tampon d'hybridation.
3. Incubez le tube à 70-75°C pendant 5 minutes pour dénaturer l'ARN.
4. Laissez l'échantillon refroidir lentement à 37°C pendant 30 minutes en plaçant le tube dans un bain-marie à 37°C. Ne refroidissez pas les échantillons rapidement en plaçant les tubes dans de l'eau froide.

Préparation des perles

1. Resuspendre les billes magnétiques dans leur flacon d'origine en les vortexant soigneusement.
Pipette 750 mL de la suspension de billes dans un tube microcentrifuge stérile, sans RNase, de 1,5 mL.
3. Placez le tube contenant la suspension de billes sur un séparateur magnétique pendant 1 minute. Les billes se déposeront du côté du tube faisant face à l'aimant. Aspirez doucement et jetez le surnageant.
Ajoutez 750 mL d'eau DEPC aux billes et resuspendez les billes en vortexant lentement.
5. Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 minute. Aspirez et jetez le surnageant.
6. Répétez les étapes 4 et 5 une fois.
7. Resuspendre les billes dans 750 mL de tampon d'hybridation et transférer 250 mL de billes dans un nouveau tube, puis maintenir le tube à 37°C pour une utilisation à une étape ultérieure.
8. Placez le tube contenant 500 mL de billes sur un séparateur magnétique pendant 1 minute. Aspirez et jetez le surnageant.
Resuspendre les billes dans 200 mL de tampon d'hybridation et conserver les billes à 37°C jusqu'à utilisation.

Élimination de l'ARNr

1. Après l'incubation à 37°C pendant 30 minutes de l'échantillon hybridé (ci-dessus), centrifugez brièvement le tube pour rassembler l'échantillon au fond du tube.
2. Transférez l'échantillon (environ 118 mL) aux billes magnétiques préparées. Pipettez de haut en bas ou utilisez un vortex à basse vitesse pour bien mélanger.
3. Incubez le tube à 37°C pendant 15 minutes. Pendant l'incubation, mélangez doucement le contenu de temps en temps. Centrifugez le tube pour recueillir l'échantillon.
4. Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 minute pour pélletiser le complexe d'ARNr. Ne jetez pas le surnageant. Le surnageant contient de l'ARN.
5. Placez le tube contenant 250 mL de billes de l'étape 7 sur un séparateur magnétique pendant 1 minute. Aspirez et jetez le surnageant.
6. À ce tube de perles, ajoutez environ 318 mL de surnageant contenant de l'ARN. Pipettez de haut en bas ou utilisez un vortex à basse vitesse pour bien mélanger.
7. Incubez le tube à 37°C pendant 15 minutes. Pendant l'incubation, mélangez doucement le contenu de temps en temps. Rassemblez l'échantillon au fond du tube en centrifugeant brièvement.
8. Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 minute pour précipiter le complexe rRNA-probe. Ne jetez pas le surnageant car il contient de l'ARN.
9. Transférez le surnageant contenant l'ARN dans un nouveau tube.

Concentration

Concentration de l'ARN par précipitation à l'éthanol

1. Transférez l'échantillon d'ARN dans un tube de microcentrifugeuse propre et sans RNase de 1,5 mL ou 2 mL.
2. Ajouter 1 mL de glycogène (20 mg/mL), 1/10 du volume de l'échantillon (ARN éluté) de l'acétate de sodium 3 M, et 2,5 fois le volume de l'échantillon d'éthanol à 100 % aux composants suivants pour l'ARN.
3. Bien mélanger et incuber à −80°C pendant au moins 30 minutes.
4. Centrifugez le tube pendant 15 minutes à 12 000 × g à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
Ajoutez 500 mL d'éthanol froid à 70 %.
6. Centrifugez le tube pendant 5 minutes à 12 000 × g à 4 °C. Jetez le surnageant sans perturber le culot.
7. Répétez les étapes 5 et 6 une fois.
8. Laissez sécher la pelote à l'air pendant environ 5 minutes. Resuspendre la pelote d'ARN dans 10-30 mL d'eau traitée au DEPC.
9. Placez l'ARN sur de la glace ou conservez l'ARN à -80°C jusqu'à utilisation.

Référence :

1. Chen Z, Duan X. Déplétion de l'ARN ribosomal pour des applications de séquençage RNA-bactérien massivement parallèle[M]//Séquençage de nouvelle génération à haut débit. Humana Press, Totowa, NJ, 2011 : 93-103.