Directions futures du séquençage CUT&Tag : Intégration multi-omique et automatisation

Séquençage CUT&Tag, en tant que technologie puissante, est devenue un outil important pour l'étude de l'épigénome, fournissant des informations approfondies sur l'organisation spatiale et fonctionnelle de la chromatine. En combinant des tests d'accessibilité de l'ADN ciblés avec le séquençage de nouvelle génération (NGS), CUT&Tag offre une vue à haute résolution des interactions protéine-ADN. Alors que le domaine continue d'évoluer, la direction future de la technologie CUT&Tag se concentrera de plus en plus sur deux aspects clés : l'intégration multi-omique et l'automatisation. Ces développements promettent d'améliorer notre compréhension des systèmes biologiques complexes et d'augmenter l'efficacité expérimentale.

1. Intégration multi-omiques : Des marqueurs uniques à l'analyse panoramique

La technologie CUT&Tag évolue d'une analyse des modifications protéiques individuelles ou des facteurs de transcription vers l'intégration de données épigénétiques multidimensionnelles. Par exemple, le Spatial CUT&Tag–RNA-seq permet le profilage simultané des modifications des histones (par exemple, H3K27me3, H3K4me3, H3K27ac) et de l'expression génique (ARN) au sein de la même coupe de tissu sur une plateforme d'omics spatiale, révélant les dynamiques spatiotemporelles dans la régulation génique. De plus, des approches multi-omics à cellule unique telles que scNano-CUT&Tag, lorsqu'elles sont combinées avec le séquençage à longues lectures, permettent une détection précise des modifications de la chromatine même dans des régions génomiques complexes — y compris les séquences répétées et les régions structurellement variables — et soutiennent l'analyse régulatoire spécifique à l'allèle. En regardant vers l'avenir, CUT&Tag pourrait être intégré avec la métabolomique et la protéomique pour construire un réseau régulatoire multidimensionnel « épigénétique-transcriptionnel-métabolique », faisant ainsi progresser le développement de la médecine de précision.

• Par exemple, l'espace de Zhang D ATACLes technologies RNA-seq et spatial CUT&Tag–RNA-seq permettent une analyse co-spectrale à l'échelle du génome de l'épigénome (accessibilité de la chromatine/modifications des histones) et du transcriptome sur des sections de tissu. Cela révèle les corrélations spatiotemporelles entre les modifications des histones et l'expression des gènes (par exemple, la corrélation positive entre les vagues de répression H3K27me3 et les marqueurs d'activation), la régulation spécifique à des régions, et la distribution spatiale des types/états cellulaires, fournissant un nouveau paradigme de "multi-omique spatiale" pour comprendre la régulation des gènes dans le développement, les neurosciences et les maladies.
• CUT&Tag spatial–RNA-seq : En utilisant des anticorps ciblant les modifications des histones (inhibition de H3K27me3, activation de H3K27ac, promoteur actif H3K4me3) combinés au complexe Protéine A-Tn5, les sites de modification des histones sont marqués via CUT&Tag, produisant un panorama complet des modifications des histones ainsi que des données sur le transcriptome.
• Co-spectroscopie génomique sans biais : Pour la première fois, une analyse conjointe à l'échelle du génome de l'épigénome (modifications ATAC/histones) et du transcriptome est réalisée sur la même section de tissu. La qualité des données (distribution des fragments, reproductibilité) est comparable à celle des techniques à modalité unique (par exemple, reproductibilité de l'ATAC spatial–RNA-seq r=0,98, reproductibilité du CUT&Tag spatial–RNA-seq H3K27ac r=0,96).
• Haute résolution et large couverture : Prend en charge 20-50 μm (contenant 1-25 cellules/pixel), les codes-barres 100×100 peuvent couvrir les hémisphères cérébraux de souris (10 000 pixels), et le design en canal serpentin peut traiter 5 échantillons simultanément.

Analyse spatiale CUT&Tag–RNA-seq du cerveau de souris en postpartum (Zhang D et al., 2023)

2. Technologie d'automatisation : De l'opération manuelle aux lignes automatisées à haut débit

L'automatisation est une avancée majeure pour l'application à grande échelle de la technologie CUT&Tag. Actuellement, les plateformes d'immobilisation sur billes magnétiques (telles que les billes magnétiques Protein A/G) ont standardisé les étapes d'incubation et de lavage des anticorps, réduisant le cycle expérimental à moins de 6 heures et diminuant considérablement la variabilité d'un lot à l'autre.

Selon des rapports, des entreprises ont développé des systèmes automatisés de manipulation de liquides qui prennent en charge la construction de bibliothèques en parallèle à 96 canaux, sont compatibles avec des stratégies de codes-barres multi-échantillons et répondent aux besoins des études de cohortes cliniques.

De plus, l'introduction de puces microfluidiques optimise encore les volumes de réaction (niveaux nanolitre), réduisant le gaspillage de réactifs et améliorant la sensibilité.

Par exemple, en s'appuyant sur la haute efficacité et le faible bruit de fond inhérents à CUT&Tag, Janssens DH et al. ont développé une version entièrement automatisée appelée AutoCUT&Tag—une mise à niveau de la plateforme précédente AutoCUT&RUN. Ce système est compatible avec le traitement robotisé en plaques de 96 puits et nécessite seulement quelques milliers de cellules pour réaliser un profilage à haut débit des modifications des histones à l'échelle du génome (par exemple, H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac) et de l'ARN polymérase II. La qualité des données obtenues est comparable à celle du CUT&Tag manuel (reproductibilité r = 0,79 ± 0,093), ce qui rend la plateforme bien adaptée aux échantillons de patients cliniques.

En utilisant AutoCUT&Tag, l'équipe a démontré que la protéine de fusion KMT2A dans la leucémie se lie principalement aux régions de chromatine active (enrichissement à l'échelle du génome) et que ses promoteurs cibles présentent souvent des marques de chromatine bivalentes (H3K4me3 + H3K27me3). L'analyse unicellulaire a en outre révélé une hétérogénéité intercellulaire reflétant la plasticité des lignées. De plus, les chercheurs ont identifié des échantillons sensibles aux inhibiteurs de DOT1L/Menin en fonction des motifs d'enrichissement des cibles, qui ciblent la méthylation aberrante de H3K79 et le complexe de transcription associé à KMT2Ar, offrant une base fonctionnelle pour le sous-typage de la leucémie et les stratégies de traitement ciblé.

Le profilage AutoCUT&Tag révèle la sensibilité thérapeutique des échantillons de leucémie KMT2Ar à l'inhibition de DOT1L (Janssens DH et al., 2021)

À l'avenir, des plateformes entièrement automatisées assistées par des robots (de la préparation des échantillons à l'analyse des données) feront entrer le CUT&Tag dans les laboratoires de routine.

3. Applications cliniques : De la recherche fondamentale à la médecine de précision

CUT&Tag démontre un potentiel significatif dans la traduction clinique :

• Sous-typage des tumeurs et surveillance de la résistance aux médicaments : En détectant des modifications telles que H3K27ac dans les cellules tumorales circulantes (CTC), la réponse à la chimiothérapie peut être prédite et la thérapie ciblée peut être guidée. Par exemple, CUT&Tag a révélé le mécanisme régulateur épigénétique de H3K18la dans le PDAC : H3K18la est enrichi dans les régions promotrices de gènes cibles tels que TTK/BUB1B, activant directement leur transcription et entraînant la progression du PDAC (d'autres études ont montré que TTK/BUB1B renforce la glycolyse et les niveaux de H3K18la par le biais d'une boucle de rétroaction positive).
• Suivi dynamique des processus : En combinant les caractéristiques de lecture en temps réel du séquençage par nanopore, le CUT&Tag peut surveiller en continu les fluctuations dynamiques des modifications de la chromatine dans la même population cellulaire (comme les changements de H3K27ac sur une période de 6 heures), révélant ainsi le mécanisme de formation de la mémoire épigénétique.
  • L'exemple : Bartosovic M et al. ont développé nano-CUT&Tag (nano-CT), une technique qui utilise une protéine de fusion nanobody-Tn5 pour se lier directement aux anticorps primaires, éliminant ainsi le besoin d'anticorps secondaires, et simplifiant ainsi le flux de travail en réduisant les étapes de lavage et le temps expérimental, tout en minimisant la perte d'échantillons, ce qui augmente la récupération nucléaire effective de 28 % à 68 %. La méthode prend en charge des échantillons à faible entrée (25 000 à 200 000 cellules) et permet un profilage multimodal simultané, tel que l'accessibilité de la chromatine (ATAC), la marque active H3K27ac et la marque répressive H3K27me3.
  • Comparé à la scCUT&Tag conventionnelle, le nano-CT produit significativement plus de fragments uniques par cellule. Par exemple, dans des échantillons de cerveau de souris P19, le nombre médian de fragments nano-CT par cellule a atteint 3 720, soit 15,8 fois plus que celui obtenu avec la scCUT&Tag. Le nano-CT présente également des caractéristiques de rapport signal sur bruit améliorées, avec un ratio de lecture de pointe (FRiP) de 35,9 % à 52,4 %, bien que cette plage diffère de celle observée avec la scCUT&Tag, qui était de 51,2 % à 69,9 %. De plus, le nombre de cycles de PCR pour la construction de la bibliothèque a été réduit de 15 cycles à seulement 6 cycles.
  • L'application de la nano-CT à la différenciation de la lignée des oligodendrocytes a révélé que la répression médiée par H3K27me3 se produit en deux phases distinctes : une répression précoce des gènes neuronaux, suivie plus tard par la répression des gènes liés aux gliales tels que Sox5 et Sox6. Ce schéma de régulation dynamique n'a pas pu être résolu par une analyse du transcriptome seule.

nano-CUT&Tag (nano-CT) (Bartosovic M et al., 2023)

• Analyse d'échantillons rares : L'analyse épigénomique peut être réalisée avec un nombre réduit de cellules (comme un échantillon de biopsie de micro-tumeur), ce qui soutient l'utilisation d'échantillons cliniques rares. Par exemple, des chercheurs ont démontré que l'étendue des caractéristiques de la chromatine de CUT&Tag (par exemple, des centaines de nucléosomes dans le domaine H3K27me3) soutient la détection par échantillonnage sparse, et les types de cellules uniques (par exemple, les cellules H1 et K562) peuvent être efficacement distingués grâce aux motifs d'enrichissement H3K27me3 à l'échelle du génome.

4. Flux de travail standardisé : De l'expérience à la donnée

Actuellement, le flux de travail expérimental de CUT&Tag repose encore sur une optimisation manuelle. À l'avenir, un système standardisé pour l'ensemble du flux de travail doit être établi :

• Normes de contrôle de la qualité : Introduire des paramètres externes de spike-in (tels que l'ADN génomique d'E. coli) pour calibrer la profondeur de séquençage, réduisant le taux d'erreur de quantification inter-échantillons à moins de 8 %.
• Outils d'analyse de données : Améliorez les workflows open-source tels que CUT&RUNTools 2.0, en intégrant l'appel de pics basé sur HMM pour les marques larges et des modules de clustering de réduction de dimensionnalité à cellule unique, supportant une analyse intégrée multi-omique en un clic.
• Validation de la Reproductibilité : Évaluer la stabilité expérimentale en utilisant des métriques telles que l'IDR (Taux de Découverte Non Reproductible) et le FRiP (Fraction de Lectures dans les Pics), et établir une base de données de validation des anticorps (comme une plateforme de dépistage d'anticorps au niveau ChIP).

5. Innovation technologique : Des lectures courtes aux lectures longues à molécule unique

La combinaison de molécules uniques séquençage à lecture longue (SMS) et CUT&Tag franchissent les goulets d'étranglement technologiques de séquençage de nouvelle génération:

• Résolution de région complexe : la technologie scNano-CUT&Tag, grâce à la capture de longs fragments à molécule unique, peut analyser avec précision les modifications H3K27me3 dans les régions hétérochromatiques et distinguer les différences à copie unique dans les éléments répétitifs génomiques.
• Analyse spécifique des allèles : en utilisant des événements de transposition flanquant des sites SNP hétérozygotes, des modifications spécifiques des allèles des gènes XIST liés à l'inactivation du chromosome X peuvent être détectées, fournissant un nouvel outil pour la recherche sur les maladies imprintées.
• Reconstruction du génome en trois dimensions : combinée avec Hi-C, elle résout les relations de co-localisation entre les interactions chromatiniennes spatiales et les modifications épigénétiques, révélant des changements dynamiques dans le génome tridimensionnel.

Résumé

Le développement futur de la technologie CUT&Tag s'articulera autour de quatre grandes orientations : l'intégration multi-omique, l'automatisation de bout en bout, l'application clinique de précision et l'innovation technologique. Grâce à la collaboration interdisciplinaire et à la normalisation, cette technologie devrait devenir un outil central pour l'analyse des réseaux de régulation génétique et la promotion du diagnostic et du traitement des maladies, et ouvrira de nouveaux paradigmes de recherche dans des domaines tels que l'épigénomique unicellulaire et les multi-omiques spatiales.

Les gens demandent aussi

Quelles sont les limitations de la méthode cut and tag ?

La principale limitation du CUT&Tag-seq est la probabilité de sur-digestion de l'ADN en raison d'un moment inapproprié de la réaction Tn5 dépendante du magnésium. Une limitation similaire existe pour les méthodes contemporaines. ChIP-Seq protocoles où le cisaillement de l'ADN enzymatique ou par sonication doit être optimisé.

Quelles sont les avancées en omique à cellule unique ?

La technologie des omiques à cellule unique a progressé rapidement depuis ses débuts, offrant une précision, une résolution et une diversité technique croissantes pour explorer les caractéristiques moléculaires spécifiques aux cellules dans le cerveau humain et les troubles neuropsychiatriques.

Quels sont les avantages de la méthode cut and tag ?

Comme d'autres méthodes de profilage de la chromatine, CUT&Tag présente certains avantages par rapport au ChIP-seq : il nécessite de faibles quantités, avec aussi peu que 100 cellules, un bruit de fond réduit, un rapport signal/bruit plus élevé, une plus grande répétabilité et un processus plus court.

Pourquoi la multi-omique est-elle l'avenir de l'analyse biologique ?

Il offre des opportunités sans précédent non seulement pour comprendre la biologie à son niveau le plus fondamental, mais aussi pour mieux comprendre les maladies, permettant un avenir où des traitements plus efficaces, plus sûrs et adaptés à un large éventail de maladies seront disponibles.

Références :

1. Zhang D, Deng Y, Kukanja P, Agirre E, Bartosovic M, Dong M, Ma C, Ma S, Su G, Bao S, Liu Y, Xiao Y, Rosoklija GB, Dwork AJ, Mann JJ, Leong KW, Boldrini M, Wang L, Haeussler M, Raphael BJ, Kluger Y, Castelo-Branco G, Fan R. Profilage co-spatial de l'épigénome et du transcriptome des tissus mammifères. Nature. 2023 avr;616(7955):113-122.
2. Bartosovic M, Castelo-Branco G. Profilage chromatin multimodal utilisant le CUT&Tag à cellule unique basé sur des nan anticorps. Nat Biotechnol. Juin 2023 ; 41(6) : 794-805.
3. Li F, Si W, Xia L, Yin D, Wei T, Tao M, Cui X, Yang J, Hong T, Wei R. La régulation de rétroaction positive entre la glycolyse et la lactylation des histones entraîne l'oncogenèse dans l'adénocarcinome canalaire pancréatique.. Cancer Mol2024 6 mai ;23(1):90.
4. Janssens DH, Meers MP, Wu SJ, Babaeva E, Meshinchi S, Sarthy JF, Ahmad K, Henikoff S. Profilage CUT&Tag automatisé de l'hétérogénéité de la chromatine dans la leucémie à lignage mixte. Nat Genet. Nov 2021;53(11):1586-1596.