Séquençage profond

Qu'est-ce que le séquençage profond ?

Le séquençage profond implique l'analyse méticuleuse des régions génomiques à travers un séquençage répété, souvent sur des centaines voire des milliers d'itérations. Cette technologie de pointe séquençage de nouvelle génération L'approche NGS permet aux chercheurs de découvrir des types de clones, des cellules ou des entités microbiennes extrêmement rares, même lorsqu'ils ne représentent qu'1 % de l'échantillon original.

Utilisant à la fois des longueurs de lecture courtes et longues, séquençage profond permet la détection de populations cellulaires insaisissables cruciales dans la recherche sur le cancer et les microbes, entre autres domaines. Son utilité s'étend à discerner de minuscules variations au sein des tumeurs, une tâche compliquée par la contamination fréquente des échantillons de cancer par des cellules normales et la présence de divers sous-clones de cellules cancéreuses au sein de la tumeur elle-même.

Qu'est-ce que la profondeur de séquençage ?

À la suite de l'avènement de séquençage profond Suite à la PCR et au séquençage de première génération, les tests génétiques ont évolué vers une phase marquée par l'adoption généralisée du NGS. Dans ce contexte, la profondeur de séquençage émerge comme une métrique clé, signifiant la spécificité et la sensibilité du séquençage profond. Mais qu'est-ce que la profondeur de séquençage ? En termes professionnels, la profondeur de séquençage désigne le rapport entre le nombre total de bases (pb) couvrant la région cible et la taille du génome cible. En d'autres termes, elle représente la fréquence à laquelle les bases du gène cible sont interprétées de manière itérative. De manière analogique, l'interprétation itérative des bases lors du séquençage profond peut être comparée à l'affinement d'une tâche répétitive, où une répétition accrue est corrélée à une plus grande habileté. Par conséquent, une profondeur de séquençage insuffisante compromet considérablement l'exactitude.

Qu'est-ce que la couverture de séquençage ?

La couverture de séquençage, en revanche, décrit la proportion de bases séquencées par rapport à la taille totale du génome. Les protocoles de séquençage de génome standard recommandent généralement une profondeur de couverture moyenne de 30×. Cette recommandation découle de l'observation qu'à cette profondeur, la proportion de couverture >4× dépasse 99,21 %, ce qui indique une approche de la saturation. De plus, à ce stade, le nombre d'hétérozygotes polymorphismes nucléotidiques simples Les SNPs tendent à se stabiliser. Des recherches indiquent qu'un séquençage à une profondeur moyenne de 15× atteint la saturation avec des SNPs purs, tandis qu'une couverture de 30× suffit pour les SNPs hétérozygotes.

La profondeur de séquençage plus élevée est-elle toujours préférable ?

Dans séquençage profond à haut débitLa profondeur de séquençage impacte directement l'exactitude de chaque base. Lors de l'analyse d'un spécimen homogène où chaque base existe sous une seule forme, une profondeur de séquençage excessivement élevée peut ne pas être essentielle pour des résultats optimaux. En revanche, dans des spécimens hétérogènes, maintenir la même profondeur de séquençage peut entraîner moins de longueurs de lecture du génome couvrant les cellules plus rares.

Compte tenu de l'impact de la profondeur de séquençage sur la précision des tests génétiques, on pourrait plaider en faveur d'une exigence de profondeur de séquençage plus élevée. De manière analogique, nous pouvons établir des parallèles avec notre vie quotidienne : tout comme la taille de notre espace de vie affecte notre niveau de confort, le coût est également une considération cruciale. Par conséquent, nous nous efforçons de trouver un équilibre optimal dans notre budget. De même, dans une certaine plage, l'augmentation de la profondeur de séquençage améliore la précision des tests. Cependant, une augmentation indéfinie de la profondeur de séquençage entraîne des rendements décroissants : alors que les coûts s'envolent, les améliorations de la précision deviennent marginales.

Comment déterminer la profondeur de séquençage

Le choix de la profondeur de séquençage appropriée dépend de divers facteurs. Dans la recherche sur le cancer, par exemple, la profondeur de séquençage requise augmente pour les tumeurs à faible pureté, à haute polyclonalité et pour les applications nécessitant une sensibilité accrue, comme l'identification de clones à faible fréquence. En général, les profondeurs de séquençage dans la recherche sur le cancer varient de 80x à plusieurs milliers de fois. Ainsi, d'un point de vue rentabilité, les tests génétiques de routine pour l'orientation de la thérapie ciblée chez les patients privilégient une profondeur optimale plutôt qu'une profondeur maximale, réservant des profondeurs de séquençage très élevées à des scénarios spécifiques.

Pour les tests NGS d'échantillons de tissu tumoral, la profondeur de séquençage efficace doit dépasser 500x, tandis que pour les spécimens d'ADN libre de plasma, elle doit surpasser 1000x.

La profondeur de séquençage et la couverture déterminent en partie le niveau de confiance associé aux variants identifiés à des positions de base spécifiques. Une profondeur et une couverture plus élevées impliquent un plus grand nombre de lectures couvrant chaque base, renforçant ainsi la confiance dans les appels de base.

Les profondeurs recommandées varient en fonction de la méthode de séquençage :

• Séquençage du génome entier (WGS) : Typiquement de 30× à 50×, en fonction de l'application et du modèle statistique.
• Séquençage de l'exome entierLa profondeur suggérée est d'environ 100×.
• Séquençage de l'ARNLa détection de gènes exprimés rares nécessite une couverture et une profondeur plus élevées.
• ChIP-SeqLa profondeur conseillée est d'environ 100×.

Technologie de séquençage profond pour l'oncologie

Les échantillons de tumeurs dans la recherche en oncologie présentent un paysage complexe, souvent composé d'un mélange de cellules normales aux côtés de multiples sous-clones de cellules tumorales. Aborder cette complexité nécessite une compréhension nuancée de la profondeur de séquençage et de son rôle essentiel dans l'amélioration de la précision et de la sensibilité des tests.

Considérations pour une profondeur de séquençage améliorée :

• Pureté Tumorale : La présence de cellules normales au sein des échantillons tumoraux pose un défi pour la détection précise des mutations. Les tumeurs avec 50 % de cellules normales nécessitent un doublement de la profondeur de séquençage pour atteindre le même niveau de confiance que les échantillons dépourvus de tissu normal.
• Hétérogénéité tumorale : La polyclonalité est une caractéristique des tumeurs avancées, soulignant la nécessité d'un séquençage plus approfondi pour saisir la diversité des types de clones présents. La profondeur du séquençage doit correspondre à la complexité de l'architecture clonale de la tumeur afin d'assurer une détection complète des variants.
• Sensibilité requise : Dévoiler des clones rares, en particulier ceux représentant à peine 1 % de la tumeur d'origine, est essentiel pour comprendre les mécanismes de résistance aux médicaments et la progression de la maladie. Atteindre ce niveau de sensibilité nécessite des profondeurs de séquençage significativement plus élevées que les normes conventionnelles, dépassant souvent 100x de couverture.

En abordant méticuleusement ces facteurs, technologie de séquençage profond élève la sensibilité et la précision des tests oncologiques, permettant aux chercheurs d'extraire des informations inestimables sur la biologie tumorale et les mécanismes de résistance thérapeutique.

Données de séquençage ultra-profond provenant d'une étude de compétence sur les biopsies liquides démontrant la validité analytique. (Gong et al., 2022)

Technologie de séquençage profond en virologie

• Virus de la grippe

Pour enquêter sur les pathogènes potentiels et leurs interactions chez les patients atteints de virus de la grippe A, Kuroda M et al. ont réalisé une analyse complète. Ils ont extrait l'ARN total des poumons de patients décédés de pneumonie virale causée par le H1N1, synthétisé de l'ADNc et effectué séquençage de novoL'étude a révélé que plus de 98 % des séquences appartenaient au génome humain, tandis que les séquences du virus H1N1 et des bactéries constituaient respectivement 0,850 % et 0,005 %.

De plus, l'étude a révélé deux phénomènes de quasi-espèces d'acides aminés dans des sites spécifiques des antigènes d'hémagglutinine du virus H1N1, Sa et Ca, corroborés par une PCR quantitative par fluorescence. De plus, l'identification d'un agent de détection bactérienne sans précédent et d'une infection bactérienne histologiquement non observée a souligné l'importance des résultats.

Ces découvertes éclairent des infections bactériennes précédemment non reconnues, suggérant une contribution plus large de pathogènes potentiels, y compris Streptococcus pneumoniae, à la morbidité et à la mortalité exacerbées associées aux infections virales par le virus de la grippe A. Par conséquent, l'adoption généralisée du séquençage profond en tant qu'outil de détection rapide et rentable des agents pathogènes s'est ensuivie.

• Application dans la détection de virus inconnus

Le rotavirus est une cause majeure de gastro-entérite aiguë chez les nourrissons dans le monde entier, la vaccination représentant une mesure préventive essentielle. Le contrôle de la qualité des vaccins nécessite la détection de facteurs exogènes, des indicateurs cruciaux de la sécurité des vaccins. En 2010, technologie de séquençage profond a facilité la détection du circovirus porcin.

Cette détection a marqué un événement significatif dans la réglementation de la sécurité des vaccins, semblable à l'incident d'intussusception, soulignant le rôle indispensable du séquençage profond dans la protection de la santé publique.

• Application dans les virus des plantes

le séquençage de nouvelle génération (NGS) comme pierre angulaire dans l'identification de pathogènes inconnus dans diverses espèces végétales. Par exemple, Li et al. ont utilisé le NGS pour analyser de petits ARN à partir d'échantillons de tomates présentant divers symptômes. En enrichissant et en assemblant des petits ARN interférents dérivés de virus (vsiARN), ils ont identifié une séquence de génome complète du viroïde de la tubercule de pomme de terre (PSTVd) et confirmé la présence de deux souches du virus du mosaïque du pepino (PepMV) dans les échantillons provenant des États-Unis. De plus, de nouvelles souches de PepMV ont été découvertes dans des échantillons mexicains, soulignant l'utilité de séquençage profond dans la découverte de nouveaux virus et souches végétaux.

Référence :

1. Gong, B., Deveson, I.W., Mercer, T. et al.Données de séquençage ultra-profond d'une étude de compétence sur la biopsie liquide démontrant la validité analytique. Données Sci 9, 170 (2022).