Application du séquençage Sanger des produits PCR

La PCR, une technique de clonage de gènes largement utilisée, permet une réplication in vitro efficace de fragments d'ADN spécifiques. En utilisant la technologie PCR, nous pouvons amplifier les gènes cibles en quantités suffisantes, répondant ainsi aux exigences des séquençages et analyses ultérieurs.

Dans la recherche actuelle, il existe généralement deux méthodes principales pour l'analyse des séquences des produits de PCR. Tout d'abord, le séquençage Sanger direct est utilisé, adapté pour détecter les mutations géniques avec des loci clairs, tels que les maladies héréditaires à gène unique limitées et l'identification des populations microbiennes, la détection du typage HLA (PCR-SBT), entre autres. Deuxièmement, les produits de PCR sont soumis à une construction de vecteurs, utilisant couramment des vecteurs T, suivie d'une transformation dans Escherichia coli. Les étapes suivantes impliquent la culture, le prélèvement de colonies et le séquençage de clones uniques avec une analyse approfondie.

Le champ d'application de la technologie de séquençage des produits de PCR directe est vaste. Elle est non seulement utilisée pour la détection des mutations génétiques, mais aussi dans l'identification des populations microbiennes, la détection du typage HLA et la validation des résultats de NGS, fournissant un soutien solide aux efforts de recherche scientifique.

Application du séquençage de Sanger dans l'analyse des produits de PCR

Détection de mutations

Les événements mutationnels induisent une variabilité dans les séquences d'ADN. Séquençage de Sanger, en tant que méthode de détection efficace et précise, identifie efficacement ces mutations, y compris les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), les insertions et les suppressions. La détection des mutations joue un rôle indispensable dans des domaines de recherche cruciaux tels que les maladies héréditaires et le cancer.

Le processus de détection des mutations est décrit comme suit :

Tout d'abord, des amorces spécifiques sont conçues pour les séquences exoniques cibles sujettes aux mutations, garantissant une capture précise de la région cible. Ensuite, l'ADN est extrait de l'échantillon pour servir de matériau de base pour les expériences ultérieures.

Ensuite, les séquences d'ADN cibles sont amplifiées à l'aide de techniques d'amplification PCR, et les produits d'amplification sont purifiés pour éliminer l'influence de l'amplification non spécifique et des impuretés. Après purification des produits d'amplification, leurs tailles sont déterminées par des méthodes telles que l'électrophorèse sur gel pour s'assurer que les produits répondent aux attentes.

Par la suite, Séquençage de Sanger Des produits d'amplification sont réalisés pour obtenir des informations de séquence d'ADN à partir de la région cible. Une fois le séquençage terminé, le chromatogramme de séquence obtenu est comparé et analysé avec la séquence de référence du gène cible afin d'identifier les sites de mutation existants et leurs types.

Enfin, pour garantir l'exactitude et la fiabilité des résultats de séquençage, des étapes de validation optionnelles peuvent être entreprises après le séquençage. Cela peut être réalisé par des méthodes telles que des kits de détection de quantification fluorescente (utilisant la méthode ARMS avec une sensibilité de 1 %), validant ainsi davantage l'exactitude des résultats de détection des mutations.

Méthodes pour la détection des mutations BRAF. (a) Évaluation comparative de la profondeur et de l'étendue des méthodes de détection des mutations BRAF. (b) Mécanisme d'enrichissement des variants par amplification par déplacement de bloqueur (BDA). Le bloqueur se lie sélectivement et inhibe l'amplification PCR des séquences d'ADN de type sauvage (WT), facilitant l'amplification préférentielle des mutations BRAF. (c) Flux de travail du test de détection des mutations BDA. Le test BDA est initialement réalisé en PCR quantitative (qPCR), suivi du séquençage Sanger des amplicons pour identifier la mutation spécifique.

Identification des microbes

Identification des microbes efforts pour atteindre une caractérisation et une classification précises de divers microorganismes englobant les bactéries, les champignons, les virus et les parasites en utilisant Séquençage de SangerCi-dessous se trouve une description concise du protocole d'identification :

Au départ, un design méticuleux de primers spécifiques cible des régions conservées représentatives au sein de l'ADN microbien d'intérêt, telles que le 16S rADN pour les bactéries ou le Région ITS pour les champignons.

Suite à la conception des amorces, une amplification efficace des régions conservées est réalisée en utilisant la technologie PCR afin de produire un approvisionnement suffisant en fragments d'ADN nécessaires pour l'analyse ultérieure.

Suite à une amplification réussie, un séquençage de première génération des produits de PCR s'ensuit pour discerner avec précision les séquences d'ADN, éclaircissant ainsi la composition génétique des micro-organismes cibles.

Lors de l'acquisition des résultats de séquençage, un alignement de séquences rigoureux et une analyse par rapport à des bases de données de gènes reconnues mondialement comme NCBI GenBank sont effectués. Cet alignement méticuleux facilite la détermination des relations entre les espèces microbiennes.

L'ensemble du processus d'identification se caractérise par sa nature rigoureuse et méthodique, garantissant la précision et la fiabilité des résultats d'identification, fournissant ainsi un soutien solide à la recherche microbienne et aux applications pratiques.

Quantifier les communautés bactériennes par séquençage Sanger. Ici, les auteurs quantifient la composition des amplicons dans des communautés bactériennes synthétiques par séquençage Sanger. Ils amplifient par PCR un gène marqueur universel, puis ils séquencent ce mélange d'amplicons dans une seule réaction de séquençage Sanger.

Typage HLA

Comparé aux méthodes basées sur la PCR telles que les essais de sondes oligonucléotidiques spécifiques à la séquence (résolution faible) et l'amplification génique par amorces spécifiques à la séquence (résolution moyenne), le typage par séquençage direct basé sur la PCR (typage basé sur la séquence, SBT) offre une résolution plus élevée. Parmi ces techniques, le séquençage Sanger classique sert d'approche de séquençage optionnelle pour le typage par séquençage direct basé sur la PCR.

Le flux de travail est décrit comme suit : Dans un premier temps, des amorces spécifiques au site sont utilisées pour amplifier sélectivement des loci HLA critiques, garantissant l'acquisition précise des séquences cibles. Par la suite, les produits amplifiés subissent Séquençage de Sanger pour obtenir des informations complètes sur la séquence de base. Enfin, les résultats du séquençage sont soigneusement analysés à l'aide de logiciels pour acquérir typage génétique HLA haute résolution information. Tout au long de ce processus, les résultats de séquençage sont alignés avec des bases de données HLA connues pour déterminer avec précision le génotype HLA spécifique d'un individu, aidant à la découverte de nouvelles variations alléliques.

Analyse comparative des méthodes de séquençage NGS et Sanger pour le typage HLA

Validation des résultats NGS

Étant donné les incertitudes multiformes affectant l'exactitude de NGS, découlant de variables telles que les systèmes d'enrichissement ciblé, les plateformes de séquençage, les pipelines bioinformatiques et l'expertise en interprétation des variants, des outils de validation fiables sont indispensables pour la vérification comparative. Parmi ceux-ci, Séquençage de Sanger La technologie, reconnue pour sa capacité à séquencer un segment d'ADN simple brin à la fois avec une précision atteignant 99,99 %, est largement reconnue et constamment utilisée comme la norme de référence pour la validation.

Le processus de validation est résumé comme suit :

Au départ, la conception précise des amorces ciblant les loci de variantes identifiés à partir de NGS la détection garantit la capture précise des régions cibles. Par la suite, grâce à l'amplification des segments cibles et à la purification des produits, des modèles de séquençage de haute qualité sont obtenus. Ensuite, Séquençage de Sanger La technologie est utilisée pour séquencer les modèles traités, fournissant des informations de séquence détaillées. Enfin, une analyse approfondie des résultats du séquençage Sanger concernant les loci variants confirme leur cohérence avec les résultats de détection NGS. Grâce à ce processus de validation rigoureux, nous pouvons évaluer plus précisément la fiabilité des résultats NGS, offrant un soutien solide pour les recherches scientifiques ultérieures ou la prise de décisions cliniques.

Séquençage de l'ADN mitochondrial

Séquençage de l'ADN mitochondrial est une technique analytique précise ciblant des loci spécifiques. Dans les cas de mutations génétiques mitochondriales suspectées, des échantillons de sang veineux périphérique sont d'abord prélevés chez les patients, à partir desquels l'ADN génomique est extrait. Par la suite, des techniques avancées NGS la technologie examine de manière exhaustive l'ensemble du séquence du génome mitochondrial du patient. Sur la base de ces résultats de détection préliminaires, une analyse de validation supplémentaire de l'ADN mitochondrial du patient est effectuée à l'aide du Séquençage de Sanger méthode sur des échantillons obtenus auprès des parents et des frères et sœurs du patient pour garantir l'exactitude et la fiabilité des résultats. Grâce à cette série de processus de séquençage rigoureux, des preuves génétiques moléculaires solides sont fournies pour le diagnostic clinique et le traitement.

Étant donné la réputation estimée du séquençage de Sanger pour ses caractéristiques de haute précision exceptionnelles, son principe de détection fondamental repose sur la capacité à lire avec précision les séquences d'ADN base par base. Par conséquent, un contrôle méticuleux de la qualité des produits de PCR, y compris leur concentration et leur pureté, est crucial pour le succès du séquençage de Sanger.

Séquençage Sanger de l'ADNmt. Électrophorégrammes générés par le séquençage Sanger dideoxy de l'ADNmt extrait de trois restes osseux anciens trouvés dans une tombe du 10ème siècle à Sigtuna, au milieu de la Suède. (Martina Nilsson)

Optimisation du séquençage Sanger : Résolution des problèmes courants

Lors de la phase préparatoire de Séquençage de SangerL'optimisation continue des conditions expérimentales est nécessaire pour maximiser la qualité et la précision des séquences. Cela implique, entre autres aspects, le réglage précis de la conception des amorces PCR et l'ajustement précis des conditions de réaction PCR. De plus, la purification des produits après la réaction PCR est indispensable. Cette étape vise à éliminer efficacement les impuretés telles que les fragments amplifiés de manière non spécifique et les séquences d'amorces, garantissant ainsi l'exactitude de la séquence du gène cible.

Cependant, dans la pratique, des facteurs tels que la concentration, la pureté et la structure des produits de PCR à séquencer peuvent entraîner une série de résultats de séquençage sous-optimaux. Pour y remédier, nous avons compilé une liste de problèmes courants et de stratégies de dépannage correspondantes pour référence pratique.

Références :

1. Cheng, L.Y., Haydu, L.E., Song, P. et al. Détection par séquençage Sanger à haute sensibilité des mutations BRAF dans des spécimens de tissu FFPE de mélanome métastatique. Sci Rep 11, 9043 (2021).
2. Cermak N, Datta MS, Conwill A. Mesure rapide et peu coûteuse de la composition des communautés bactériennes synthétiques par séquençage Sanger de mélanges d'amplicons. iScience. 2020
3. Syndercombe Court D. ADN mitochondrial dans l'utilisation judiciaire. Emerg Top Life Sci. 2021