Séquençage Sanger : Introduction, Flux de travail et Applications

Qu'est-ce que le séquençage de Sanger ?

Séquençage de SangerUne méthode de séquençage de l'ADN repose sur l'incorporation sélective de didéoxynucléotides terminant la chaîne lors de la réplication in vitro de l'ADN, guidée par l'action de l'ADN polymérase. Cette technique a été pionnière par Frederick Sanger et son équipe en 1977, d'où le terme "séquençage de Sanger". Un élément crucial de la méthode de séquençage de Sanger est le phénomène de terminaison de la réaction de l'ADN polymérase provoqué par les triphosphates de didéoxynucléotides (ddNTPs) — un principe qui a conduit à l'autre nom de la technique, le "séquençage par terminaison didéoxy". Prouvant son efficacité et sa fiabilité, cette méthode a été la technique de séquençage la plus largement utilisée pendant près de quatre décennies.

Le Séquençage de Sanger méthode, soutenue par un taux de précision de 99,99 % dans l'identification de base, est largement considérée comme la « norme d'or » pour la vérification des séquences d'ADN. Cela inclut les séquences d'ADN initialement déchiffrées à l'aide de séquençage de nouvelle génération techniques. Le Projet Génome Humain, par exemple, a utilisé Séquençage de Sanger pour déterminer les séquences de fragments relativement courts de l'ADN humain, chacun comprenant 900 paires de bases ou moins. Ces fragments ont servi de blocs de construction pour assembler des sections d'ADN plus grandes, qui, à leur tour, ont été assemblées pour construire des chromosomes entiers.

Figure 1. Réaction de terminaison de chaîne dans le séquençage de Sanger. (Saini et al., 2023)

Flux de travail de séquençage Sanger

Séquençage de Sanger implique principalement la formation d'un système de réaction, l'amplification du segment cible, l'électrophorèse sur gel et la lecture de séquence. Le processus de Séquençage de Sanger se compose d'un ensemble de quatre réactions distinctes, chacune englobant : (1) les quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs), essentiels pour la synthèse normale de l'ADN ; (2) l'inclusion de quatre didésoxyribonucléotides triphosphates (ddNTPs) distincts dans chaque système de réaction. Étant donné que les ddNTPs sont dépourvus du groupe 3-OH requis pour l'élongation, les oligonucléotides amplifiés se terminent sélectivement par G, A, T ou C. Pour un positionnement efficace, ceux-ci sont marqués par fluorescence ou isotopes. (3) Le fragment cible, l'ADN polymérase et les amorces constituent tous le système de réaction.

Par la suite, le fragment cible sert de modèle sous la catalyse de l'ADN polymérase, initiant la réplication de l'ADN à partir des amorces. Lorsqu'ils rencontrent des ddNTPs, la réaction s'arrête. L'électrophorèse sur gel qui suit vise à séparer ces fragments d'oligonucléotides terminés. Enfin, les fragments sont soumis à un courant électrique pour induire la formation de bandes. Sous l'influence combinée du courant électrique et de la résistance du gel, des bandes régulières émergent longitudinalement à intervalles égaux, représentant des longueurs de séquence variées, chacune correspondant à une séquence A-T-G-C.

Figure 2. Flux de travail général du séquençage de Sanger

Il y a trois étapes principales pour Séquençage de Sanger les suivants :

Séquence d'ADN pour la PCR de terminaison de chaîne

La séquence d'ADN d'intérêt est utilisée comme modèle pour un type spécial de PCR appelé PCR par terminaison de chaîne. La PCR par terminaison de chaîne fonctionne exactement comme la PCR standard, mais avec une différence majeure : l'ajout de nucléotides modifiés appelés didéoxyribonucléotides. Lors de l'étape d'extension de la PCR standard, l'ADN polymérase ajoute des dNTPs à une chaîne d'ADN en croissance en catalysant la formation d'une liaison phosphodiester entre le groupe 3'-OH libre du dernier nucléotide et le 5'-phosphate du suivant.

Séparation par taille par électrophorèse sur gel

Dans la deuxième étape, les oligonucléotides terminés par une chaîne sont séparés par taille via électrophorèse sur gel. Dans l'électrophorèse sur gel, des échantillons d'ADN sont chargés à une extrémité d'une matrice de gel, et un courant électrique est appliqué ; l'ADN est chargé négativement, donc les oligonucléotides seront attirés vers l'électrode positive de l'autre côté du gel. Comme tous les fragments d'ADN ont la même charge par unité de masse, la vitesse à laquelle les oligonucléotides se déplacent sera déterminée uniquement par leur taille. Plus un fragment est petit, moins il subira de friction en se déplaçant à travers le gel, et plus il se déplacera rapidement. En conséquence, les oligonucléotides seront disposés du plus petit au plus grand, en lisant le gel de bas en haut.

Analyse de gel et détermination de la séquence d'ADN

La dernière étape consiste simplement à lire le gel pour déterminer la séquence de l'ADN d'entrée. Comme l'ADN polymérase ne synthétise l'ADN que dans la direction 5' à 3', en commençant à partir d'un amorce fourni, chaque ddNTP terminal correspondra à un nucléotide spécifique dans la séquence originale (par exemple, le fragment le plus court doit se terminer au premier nucléotide de l'extrémité 5', le deuxième fragment le plus court doit se terminer au deuxième nucléotide de l'extrémité 5', etc.). Par conséquent, en lisant les bandes du gel du plus petit au plus grand, nous pouvons déterminer la séquence de l'ADN original dans le sens 5' à 3'.

Figure 3. Aperçu du séquençage Sanger

Avantages du séquençage de Sanger

Séquençage de Sanger est une méthodologie éprouvée célèbre pour sa grande précision. Cette technique classique détermine méticuleusement l'ordre des bases dans l'ADN, particulièrement efficace lorsqu'elle est appliquée à des fragments d'ADN relativement courts. Réputée pour sa robustesse, le mécanisme simple et le processus cohérent de Séquençage de Sanger mène à un haut degré de fiabilité. Avec un fonctionnement approprié, il fournit des résultats constants et reproductibles.

Son applicabilité est large et adaptable, facilitant des projets de différentes échelles, allant du séquençage de gènes uniques à celui de génomes entiers. Par conséquent, il trouve une large utilisation dans la recherche, le diagnostic clinique et d'autres domaines. Comparé à certains NGS les technologies, les équipements associés et les coûts des réactifs du séquençage Sanger sont nettement inférieurs. Par conséquent, c'est une option attrayante pour les projets disposant de budgets limités. En ce qui concerne le séquençage de longs fragments d'ADN, Séquençage de Sanger présente des performances supérieures par rapport à certains homologues de nouvelle génération. Cela est d'une importance capitale pour les projets nécessitant le séquençage de gènes complets ou de régions spécifiques.

Applications du séquençage de Sanger

Le séquençage ADN par Sanger est largement utilisé à des fins de recherche telles que (1) le ciblage de régions génomiques plus petites dans un plus grand nombre d'échantillons, (2) le séquençage de régions variables, (3) la validation des résultats des études NGS, (4) la vérification des séquences de plasmides, des inserts, des mutations, (5) le typage HLA, (6) le génotypage de marqueurs microsatellites, et (7) l'identification de variantes génétiques uniques responsables de maladies.

Figure 4. Exemples de séquences. Une bonne séquence d'acide nucléique. (Crossley et al., 2020)

Séquençage de Sanger est essentiel dans de nombreux domaines de recherche même aujourd'hui.

Dans la recherche en génomique, ce processus est essentiel pour la localisation et le clonage des gènes en identifiant et en localisant les gènes, ainsi qu'en vérifiant l'exactitude des segments clonés. Même si le séquençage génomique ne peut rivaliser avec la vitesse de NGS technologies, Séquençage de Sanger se défend bien lorsqu'il s'agit de séquencer de petits génomes ou des régions spécifiques de gènes. Il s'avère également utile pour détecter des mutations telles que les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ainsi que des insertions ou des délétions. Dans l'évolution moléculaire, Séquençage de Sanger est utilisé pour l'identification des espèces en comparant les séquences génétiques d'espèces connues afin de déterminer la phylogénie de celles inconnues. En séquençant l'ADN de diverses espèces, nous pouvons dévoiler le lien de parenté et l'histoire évolutive de nombreuses espèces. De plus, cela s'avère instrumental dans le diagnostic médical pour identifier les variations génétiques liées aux maladies génétiques et détecter les mutations d'oncogènes dans les cellules tumorales pour orienter le traitement.

Dans les secteurs de l'agriculture et de la protection de l'environnement, il est utilisé pour l'identification des races en déterminant les variétés ou le lien de parenté des cultures et du bétail. De plus, l'analyse de l'ADN environnemental réalisée par le séquençage de l'ADN dans des échantillons environnementaux donne un aperçu de la biodiversité et de la santé des systèmes écologiques. Les applications judiciaires de Séquençage de Sanger sont observés dans l'identification personnelle par le séquençage de l'ADN d'un individu pour l'identification judiciaire et la reconnaissance personnelle. L'identification par empreinte ADN, qui utilise cette méthode, aide à l'analyse des preuves ADN dans les affaires criminelles et à la confirmation de l'identité d'un suspect. De plus, les applications émergentes incluent le séquençage de cellules uniques, en conjonction avec des technologies de cellules uniques pour explorer l'expression génique et les mutations de cellules uniques. Le domaine de l'épigénétique présente Séquençage de Sanger dans l'identification des marqueurs épigénétiques tels que la méthylation de l'ADN ou la modification des histones pour obtenir de meilleures informations sur la régulation épigénétique. En biologie synthétique, il est utilisé pour vérifier l'exactitude et la fonction des séquences d'ADN synthétiques.

Limitations du séquençage de Sanger

Champ d'application limité : Le Séquençage de Sanger La méthode n'est pas idéalement adaptée à l'analyse de séquences d'ADN plus longues ou à des projets de séquençage à grande échelle. En raison de sa complexité et de son coût, elle est plus appropriée pour des projets à petite échelle avec des objectifs spécifiques.

Longueur de séquençage restreinte : La longueur des séquences qui Séquençage de Sanger la décodage est limité par les triphosphates de didéoxynucléotides (ddNTP) spécifiques utilisés lors du processus de réaction. Cela nécessite plusieurs cycles de réactions et d'analyses pour le séquençage de longs fragments, ce qui, à son tour, augmente la charge de travail et le coût en temps.

Faible débit : Comparé à certaines technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), Séquençage de Sanger a un débit relativement plus faible. Par conséquent, moins de séquences peuvent être complétées dans le même laps de temps, ce qui le rend inadapté aux projets de séquençage étendus.

L'influence de l'opération manuelle sur la précision : L'analyse par électrophorèse sur gel et l'interprétation des chromatogrammes de séquence, composants intégrants du processus de séquençage de Sanger, nécessitent souvent une intervention manuelle. Cela introduit un risque de jugement subjectif et d'erreurs d'opération, affectant par conséquent l'exactitude du résultat du séquençage.

Comparaison entre le séquençage Sanger et le séquençage à haut débit (NGS)

Dans le discours concernant Séquençage de Sanger et séquençage de nouvelle générationnous abordons implicitement l'évolution et les avancées des techniques de séquençage de l'ADN. Le séquençage Sanger, une technique de séquençage précoce, a été salué pour sa fiabilité et sa précision. Néanmoins, avec le cours de la progression scientifique, les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont émergé, propulsant de manière significative le développement dans le domaine du séquençage de l'ADN. Il existe des différences notables entre Séquençage de Sanger et NGS technologies dans des aspects tels que leurs principes, leur débit, leur vitesse, leurs coûts, leur gamme d'applications et l'analyse des données.

Principes et techniques :

La méthode de Sanger adopte la méthode de terminaison de chaîne. Cette technique utilise des terminateurs de chaîne di-désoxy étiquetés avec des couleurs de fluorescence distinctes, permettant l'incorporation d'une base spécifique à chaque position sur le brin d'ADN.

NGS les technologies représentent un ensemble de méthodes de séquençage à haut débit émergentes, permettant le séquençage massif de l'ADN à grande échelle. Ces techniques, y compris Illumina, Ion Torrent, PacBio, et d'autres, permettent le séquençage simultané de nombreux fragments d'ADN, améliorant considérablement la vitesse et l'efficacité du séquençage.

Débit et Vitesse :

Séquençage de Sanger est généralement limité à la gestion d'un nombre modeste de fragments d'ADN, avec un rythme relativement plus lent. En revanche, les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) atteignent un débit et une vitesse plus élevés, capables de traiter simultanément des centaines de millions à des milliards de fragments d'ADN et d'accomplir un séquençage génomique complet dans une durée considérablement réduite.

Coût :

Séquençage de Sanger tend à être relativement coûteux, en particulier en ce qui concerne les projets de séquençage à grande échelle. NGS les technologies, quant à elles, s'avèrent plus rentables en raison de leur capacité à séquencer un grand nombre de fragments d'ADN à la fois, réduisant ainsi le coût par fragment.

Champ d'application :

Séquençage de Sanger est généralement impliqué dans des projets de séquençage à plus petite échelle, tels que le séquençage de gènes uniques ou de régions spécifiques de l'ADN. NGS les technologies trouvent leurs applications étendues dans divers domaines, y compris la génomique, la transcriptomique et l'épigénomique, permettant un séquençage de l'ADN à grande échelle, approfondi et haute résolution.

Analyse des données :

Le volume de données modeste rend l'analyse relativement simpliste pour Séquençage de SangerCependant, le volume de données considérablement plus important généré par NGS appelle ordinairement à des outils et des algorithmes de bioinformatique complexes pour le traitement et l'interprétation.

Tableau 1 Comparaison des avantages et des inconvénients du séquençage Sanger et du séquençage de nouvelle génération (NGS)

Chacune de ces approches de séquençage, y compris Séquençage de Sanger, séquençage de nouvelle générationet le séquençage de troisième génération, présente ses propres avantages et inconvénients. Il est conseillé de choisir la méthode qui convient le mieux à l'objectif de recherche et à l'échantillon étudié.

Références :

1. Crossley BM, Bai J, Glaser A, et al. Lignes directrices pour le séquençage Sanger et le suivi des tests moléculaires. Journal de l'investigation diagnostique vétérinaire. Nov 2020 ;32(6).
2. Mardis ER. Technologies de séquençage de l'ADN : 2006–2016. Protocoles de la natureFévr. 2017 ; 12(2).
3. Saini M K, Gaurav H B, Kumar J, et al. Techniques de séquençage de l'ADN : de Sanger au séquençage de nouvelle génération. ADN, 2023, 3(09) : 2378-2393.
4. Crossley B M, Bai J, Glaser A, et al. Directives pour le séquençage Sanger et le suivi des tests moléculaires. Journal de l'Investigation Diagnostique Vétérinaire, 2020, 32(6) : 767-775.