Protocole de séquençage des récepteurs B à base de NGS

Amplification de VH-Cg, VH-Ca ou VH-Cμ à partir de cDNA

1. Préparez un mélange maître de PCR composé de 28,3 μl d'eau, 5 μl de tampon Gold 10×, 3 μl de MgCl2, 0,5 μl de dNTPs, 1 μl de BSA et 0,2 μl de Taq Gold.
2. Transférez le mélange maître de PCR dans les tubes de réaction PCR (38 μl dans chaque puits).
3. Déposez 1 μl de chaque amorce dans le puits correspondant.
4. Ajoutez 5 μl de cDNA dans le puits correspondant, puis ajoutez délicatement le couvercle des tubes PCR.
5. Effectuer une PCR à 95 °C pendant 7 min ; 25 à 35 cycles à 94 °C pendant 30 s, 57 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min ; 72 °C pendant 10 min.
6. Charger 50 μl de produit PCR avec 10 μl de colorant de chargement sur un gel d'agarose à 1 % dans un tampon TBE contenant du bromure d'éthidium et faire fonctionner pendant 1 h à 180 V.
7. Visualisez la bande d'ADN sous lumière ultraviolette (UV) et découpez la bande de PCR d'environ 500 pb du gel à l'aide d'un scalpel.
8. Purifiez le produit de PCR à partir du gel en utilisant le kit d'extraction de gel. Suivez les instructions dans le manuel et éluez avec 20 μl de tampon d'élution.
9. Poursuivre avec le sous-titre 3.3, PCR imbriquée.

Amplification de VH-JH à partir de l'ADN

1. Préparez un mélange maître de PCR composé de 31,3 μl d'eau, 5 μl de tampon Gold 10×, 3 μl de MgCl2, 0,5 μl de dNTPs, 1 μl de BSA et 0,2 μl de Taq Gold.
2. Transférez le mélange maître de PCR dans les tubes de réaction PCR (41 μl dans chaque puits).
Déposez 1 μl de chaque amorce (6 amorces 5′ et 1 amorce Cg ou Ca par puits) dans le puits correspondant.
4. Ajoutez 2 μl de DNA à 50 ng/μl dans le puits correspondant, puis placez délicatement le couvercle des tubes PCR.
5. Effectuer une PCR à 95 °C pendant 7 minutes ; 25 à 35 cycles à 94 °C pendant 30 secondes, 57 °C pendant 30 secondes, 72 °C pendant 1 minute ; 72 °C pendant 10 minutes.
6. Charger 50 μl de produit PCR avec 10 μl de colorant de chargement sur un gel d'agarose à 1 % dans un tampon TBE contenant du bromure d'éthidium et faire courir pendant 1 h à 180 V.
7. Visualisez la bande d'ADN sous lumière ultraviolette (UV) (voir Note 7), et découpez la bande de PCR d'environ 500 pb du gel à l'aide d'un scalpel.
8. Purifiez le produit PCR à partir du gel en utilisant le kit d'extraction de gel. Suivez les instructions dans le manuel et éluez avec 20 μl de tampon d'élution.

PCR en nested et regroupement

1. Ajoutez 12,5 μl de KAPA HiFi Hotstart Ready mix, 2 μl de l'amorce avant TruSeq Custom Amplicon, 2 μl de l'amorce arrière TruSeq Custom Amplicon et 8,5 μl de produit PCR purifié dans un tube de réaction PCR.
2. Effectuer une PCR à 95 °C pendant 5 min ; 10 cycles à 98 °C pendant 20 s, 66 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s ; 72 °C pendant 1 min.
3. Mesurez la concentration des produits de PCR.
4. Mélangez le produit de PCR à une concentration équimolaire de 50 mM.
5. Purifiez le pool de produits PCR.
6. Le pool de PCR peut être séquencé en utilisant la plateforme Illumina.

Fusion, découpage et alignement des lectures avec Galaxy

1. Le séquençage avec la plateforme Illumina génère des lectures R1 et R2 qui doivent être fusionnées avant de pouvoir être alignées sur une base de données de référence.
2. Après que les lectures aient été fusionnées, les adaptateurs de primers Illumina Rd1 et Rd2 doivent être retirés des lectures ainsi que les primers avant.
3. Avant que les lectures puissent être alignées à l'aide d'IMGT/HighV-Quest, les fichiers FASTQ doivent être adaptés au format de fichier FASTA. Cela peut être fait avec le convertisseur FASTQ en FASTA.
4. Pour l'alignement et l'annotation des réarrangements du BCR, le système international ImMunoGeneTics IMGT/HighV-Quest peut être utilisé.

Analyse des données à l'aide du pipeline de répertoire immunitaire dans Antigen Receptor Galaxy

1. Ouvrez ARGalaxy.
2. Téléchargez les fichiers .txz compressés en utilisant : obtenir des données → télécharger un fichier. Le fichier apparaîtra sur le côté droit de votre écran sous "Historique."
3. Sélectionnez sous "Outils" sur le côté gauche de l'écran "ARGalaxy", puis cliquez sur le "pipeline du répertoire immunitaire."
4. Sélectionnez le fichier .txz que vous souhaitez analyser.
5. Entrez un nom dans le champ "ID".
6. Sélectionnez la définition du clonotype.
7. Sélectionnez l'ordre dans lequel les gènes V, D et J doivent apparaître dans les graphiques. Le paramètre par défaut est l'ordre alphabétique et non l'ordre dans lequel ils apparaissent sur le locus IGH.
8. Sélectionnez "IGH" dans le champ "Locus".
9. Choisissez si vous souhaitez visualiser les réarrangements non productifs dans les graphiques.
10. Sélectionnez si vous souhaitez identifier des séquences chevauchantes entre différents réplicats au sein d'un même donneur.
11. Appuyez sur exécuter. Un nouvel élément s'affichera dans votre historique et deviendra vert lorsque l'outil sera prêt à traiter les données.
12. Cliquez sur le symbole "œil" pour ouvrir le tableau qui montre un aperçu des réarrangements, y compris le pourcentage de productifs, de uniques productifs, d'improductifs et d'improductifs uniques.
13. Appuyez sur "Cliquez ici pour les résultats" pour ouvrir la page avec les différents onglets d'analyse.
14. L'onglet "Fréquences des gènes" montre le pourcentage d'utilisation des gènes V, D et J. La fréquence des différents gènes V, D et J varie légèrement entre les individus et également entre les différents jeux de primers utilisés pour amplifier les réarrangements du BCR.
15. L'onglet "Caractéristiques du CDR3" contient des graphiques montrant la distribution de la longueur du CDR3 et la fréquence des différents acides aminés utilisés dans le CDR3. La longueur médiane du CDR3 est plus longue dans les cellules B naïves par rapport aux cellules B mémoire, ce qui est probablement dû à une sélection contre les longueurs de CDR3 longues, car elles sont plus susceptibles d'être autoréactives.
16. Dans l'onglet "Cartes de chaleur", la fréquence des différentes combinaisons de gènes V-J, V-D et D-J est visualisée dans des cartes de chaleur.
17. Dans l'onglet "Comparer les cartes thermiques", les cartes thermiques entre différents donneurs peuvent être comparées.
18. Dans l'onglet "Circos", la fréquence des différentes combinaisons de gènes V-J, V-D et D-J est visualisée à l'aide de graphiques circulaires.
19. Lorsque l'option est choisie pour déterminer le nombre de séquences partageant le même type clonale entre les réplicats ou pour déterminer la clonalité du donneur, l'onglet "Types Clonaux Partagés" ou "Clonalité" est affiché. Ces onglets incluent un tableau avec des informations sur le nombre de réarrangements BCR présents dans plusieurs réplicats du même donneur. Lorsque trois réplicats sont présents et que l'option "déterminer la clonalité du donneur" est choisie, le score de clonalité basé sur la publication de Boyd et al. est donné. Chez les patients atteints d'IEI, la diversité du répertoire est souvent réduite.
20. L'onglet "Analyse des jonctions" contient un tableau avec le nombre médian ou moyen de délétions, de nucléotides palindromiques (P) ou de nucléotides non templés (N) dans les réarrangements productifs et non productifs. Des défauts génétiques dans la voie de réparation par jonction non homologue (NHEJ) ont montré qu'ils affectent le nombre de délétions, de nucléotides N et de nucléotides P.
21. Dans l'onglet "Télécharger", toutes les données utilisées pour créer les tableaux et les graphiques peuvent être téléchargées. 

Référence :

1. Schouwenburg P A, Burg M, IJspeert H. Analyse du répertoire des récepteurs B à base de NGS Analyse des répertoires dans le contexte des erreurs innées de l'immunité[M]//Immunogénétique. Humana, New York, NY, 2022 : 169-190.