Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage MeRIP
Questions générales
- Le séquençage meRIP peut-il étudier les modifications m6A de l'ARN ?
- Absolument. Actuellement, les modifications m6A dans l'ARN sont principalement étudiées par MeRIP-seq.
- Le m6A peut-il être analysé en association avec l'ARN circ ?
- Oui, nous pouvons. Nous pouvons construire une bibliothèque uniquement pour l'ARN circulaire, afin de collecter 5 µg d'ARN circulaire pour l'enrichissement.
- Est-il vrai que le m6A-seq n'a pas besoin d'être supérieur à 3 échantillons par groupe, et est-il acceptable de faire du m6A sans duplicats et seulement une fois par échantillon ?
- À l'exception des échantillons de lignées cellulaires, qui peuvent être réalisés avec seulement 2 réplicats (généralement pour deux méthodes différentes de shRNA ou siRNA), il est habituel que même les cellules primaires soient constituées de trois réplicats biologiques.
- Pourquoi les gènes des chloroplastes et des mitochondries sont-ils comparés dans les données MeRIP ?
- La construction de la bibliothèque MeRIP est basée sur la quantité d'ARNm pour déterminer le type de construction de la bibliothèque. Si les gènes chloroplastiques et mitochondriaux sont appariés dans les données MeRIP, il s'agit probablement d'un problème d'extraction, il n'existe pas de bonne méthode pour éliminer les mitochondries et les chloroplastes, la seule solution est d'augmenter le volume de séquençage pour accroître les données valides.
- MeRIP et RIP sont-ils similaires ?
- MeRIP (également connu sous le nom de m6A-IP) et RIP diffèrent en ce sens qu'ils ont des objectifs expérimentaux différents : le premier détecte le niveau de m6A d'un gène, tandis que le second détecte l'ARNm lié à une protéine de lecture. L'anticorps m6A peut théoriquement se lier à tout ARN avec modification m6A avec une spécificité de 99 % et il n'y a pas d'enrichissement non spécifique.
- Comment concevoir des expériences de MeRIP-seq ?
- • Échantillons : Cellules, tissus, ARN total après extraction (limité aux espèces avec génome de référence).
• Regroupement : Modèle cellulaire : groupe expérimental et groupe témoin, 3:3 recommandé
• Tissus : groupe normal et groupe malade, 5:5 recommandé
• Contrôle intra-groupe : groupe IP et groupe d'entrée
- • Échantillons : Cellules, tissus, ARN total après extraction (limité aux espèces avec génome de référence).
- Dois-je interrompre après l'enrichissement en ARN dans le MeRIP-seq ?
- Il est possible d'interrompre ou de ne pas interrompre. Si vous souhaitez interrompre, veuillez vous assurer que la cible est uniquement l'ARNm ou lncARN non codant avant d'interrompre. S'il ne s'agit que d'ARNm, vous pouvez utiliser des billes oligo dT pour l'enrichir d'abord, puis l'interrompre. Si à la fois l'ARNlnc et l'ARNm doivent être étudiés, l'ARNr de l'ARN total doit être digéré avec le kit avant l'interruption.
- Comment éluer l'ARN de l'anticorps m6A si mon volume d'ARN est faible ?
- Si la quantité de départ d'ARN est faible, le volume d'élution (tampon d'élution) peut être augmenté de 25 à 30 % et le nombre d'élutions peut être augmenté de 2 à 4-6 fois.
- Comment extraire l'ARN après une IP ?
- L'ARN provenant de l'IP peut être extrait en utilisant un mélange de phénol : chloroforme : alcool isoamyle dans un rapport volumique de 25:24:1, ou en ajoutant directement le réactif Trizol.
- Quel est votre processus de construction et de séquençage de bibliothèque MeRIP-seq ?
- Chaque ensemble de MeRIP-seq se compose de deux types d'échantillons : l'échantillon d'immunoprécipitation (IP) et l'échantillon de contrôle d'Input. Les molécules d'ARN sont d'abord fragmentées en fragments de 100 à 200 nt. L'échantillon IP fournit une mesure non biaisée du fragment d'ARN méthylé au moyen d'un anticorps spécifique anti-m6A. Pendant ce temps, l'échantillon de contrôle d'Input reflète l'abondance de l'ARN de base. La localisation de l'ensemble du transcriptome m6A est déterminée par la construction de la bibliothèque, le séquençage à haut débit et l'analyse bioinformatique.
- Quels services d'analyse MeRIP-seq proposez-vous ?
Analyse de base Analyse avancée Évaluation de la qualité des données de séquençage Analyse de l'expression différentielle des gènes méthylés Contrôle qualité Analyse d'enrichissement de la fonction GO des gènes de méthylation différentielle Analyse de la couverture génétique Analyse des voies KEGG de méthylation différentielle des gènes Identification des pics m6A Analyse des voies réactomiques des gènes de méthylation différentielle annotation des pics m6A Analyse de l'expression différentielle des lncARNs méthylés analyse de l'ARNm m6A Analyse d'enrichissement fonctionnel GO des gènes cis-encodés par des lncRNAs différentiellement méthylés Analyse des motifs des ARNm méthylés Analyse des voies KEGG des gènes cis-codants des lncRNAs différentiellement méthylés Analyse des lncRNA m6A Analyse de chemin Reactome des gènes cis-encodants des lncRNAs différentiellement méthylés Analyse des motifs de l'lncRNA méthylé Analyse de l'expression différentielle des circARN méthylés analyse de reconnaissance et d'identification des circRNA Analyse d'enrichissement fonctionnel GO des gènes hôtes circRNA différemment méthylés Analyse d'enrichissement de l'ARNm m6A des circRNA Analyse des voies KEGG des gènes hôtes de circRNA différentiellement méthylés Analyse des motifs de circRNA méthylés Analyse de la voie Reactome des gènes hôtes circRNA différentiellement méthylés
- Quelles sont les validations expérimentales ultérieures du MeRIP-seq ?
- MeRIP-qPCR. Après avoir enrichi l'ARN avec des modifications de méthylation à l'aide d'anticorps m6A, l'étape suivante consiste à quantifier l'ARN enrichi directement par qPCR. Il est recommandé de combiner avec l'expression génique RT-qPCR, WB et d'autres moyens de validation pour vérifier les résultats des tests.
- Est-il nécessaire de réaliser un MeRIP-seq en plus du séquençage transcriptomique normal ?
- Non, les données d'entrée peuvent être analysées normalement. données de séquençage de transcriptome complet.
- Pourquoi est-il nécessaire de réaliser à la fois des échantillons d'entrée et des échantillons IP pour le MeRIP-seq ?
- Dans la configuration expérimentale MeRIP-seq, l'Input et l'IP forment une paire d'échantillons. Les échantillons IP sont spécifiquement enrichis en anticorps m6A pour les fragments d'ARN modifiés par méthylation, tandis que l'Input est simplement de l'ARN fragmenté servant de contrôle pour réduire le bruit de fond, et la construction de la bibliothèque ainsi que le séquençage sont réalisés en parallèle. L'analyse combinée de détection de pics nécessite l'intégration des données des deux échantillons et l'utilisation des données d'Input pour exclure les pics avec des niveaux d'expression de fond élevés ou des liaisons non spécifiques afin d'améliorer la précision de l'identification des pics.
- Y a-t-il des restrictions d'espèces pour réaliser le MeRIP-seq ?
- Si ce n'est pas humain, les espèces de souris et de rats sont recommandées pour être consulté En général, les espèces avec un génome de référence, un épissage du génome au niveau des chromosomes et des fichiers d'annotation GTF complets peuvent être traitées ; il est recommandé d'évaluer d'abord les projets eucaryotes, procaryotes ou viraux, car il existe des différences dans les logiciels et les paramètres impliqués dans la détection des pics de liaison.
Préparation des échantillons
- Quelles sont les exigences de livraison d'échantillons pour le MeRIP-seq ?
- • Type d'échantillon : cellule, tissu, ARN total
• MeRIP-seq conventionnel : ARN total ≥ 25 μg après digestion par la Dnase, concentration ≥ 100 ng/μg, RIN ≥ 8.
• Autres espèces : ARN total ≥ 150 μg, concentration ≥ 100 ng/μg, RIN ≥ 8
- • Type d'échantillon : cellule, tissu, ARN total
- Est-il préférable d'utiliser directement l'ARN ou l'ADNc pour le MeRIP-seq ?
- Après l'extraction de l'ARN total, mettez-le dans de l'eau NF et conservez-le à -80°C pendant au moins 2 à 4 semaines. Si un enrichissement en ARNm est effectué pour l'ARN total, veuillez réaliser l'expérience immédiatement dans les 2 jours, sinon l'ARNm sera gravement dégradé.
En ce qui concerne l'ADNc, s'il existe une situation d'expédition à longue distance, il n'est pas recommandé d'envoyer de l'ARN, ou d'envoyer principalement de l'ADNc. À ce moment-là, vous pouvez rétrotranscrire le produit à partir de l'Input et de l'IP et le mettre dans de l'eau NF pour un transport sur glace carbonique.
- Après l'extraction de l'ARN total, mettez-le dans de l'eau NF et conservez-le à -80°C pendant au moins 2 à 4 semaines. Si un enrichissement en ARNm est effectué pour l'ARN total, veuillez réaliser l'expérience immédiatement dans les 2 jours, sinon l'ARNm sera gravement dégradé.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
Services associés
