Directives de Soumission d'Échantillons
Questions et réponses sur le séquençage des LncRNA
Questions générales
- Quelle est votre stratégie de construction de bibliothèque et de séquençage pour le séquençage du transcriptome des LncRNA ?
- Extraire l'ARN total de l'échantillon, éliminer l'ARN ribosomique et construire une bibliothèque spécifique à la chaîne, c'est-à-dire une bibliothèque de lncRNA. Basé sur la plateforme Illumina NoveSeq 6000, un séquençage double extrémité PE250 est réalisé.
Séquençage : Depuis le lncARN non codant La bibliothèque contient des informations sur l'ARNm et l'ARNlnc, et l'abondance de l'ARNlnc est faible. Le volume de données recommandé est de 10 à 12 Go de données brutes par échantillon pour les mammifères tels que l'homme, le rat et la souris.
- Extraire l'ARN total de l'échantillon, éliminer l'ARN ribosomique et construire une bibliothèque spécifique à la chaîne, c'est-à-dire une bibliothèque de lncRNA. Basé sur la plateforme Illumina NoveSeq 6000, un séquençage double extrémité PE250 est réalisé.
- Pourquoi l'ARNr devrait-il être éliminé lors du séquençage de l'ARNlnc et de la construction de la bibliothèque ?
- Seul l'extrémité 3' de l'lncRNA porte une structure polyA, les autres lncRNAs n'ont pas de structure polyA, donc l'enrichissement par billes magnétiques oligo(dT) n'est pas recommandé pour obtenir des informations plus complètes sur les lncRNA.
- Quelles sont les exigences en matière d'espèces pour le séquençage des lncRNA ?
- • L'espèce a un génome de référence, épissé au moins au niveau du scaffold.
• Une annotation plus complète est disponible.
- • L'espèce a un génome de référence, épissé au moins au niveau du scaffold.
- Comment prédire les gènes cibles des lncRNA ?
- L'lncRNA peut réguler les gènes cibles par co-localisation et co-expression en tant qu'ARN régulateur. La prédiction des gènes cibles par co-localisation est basée sur le principe selon lequel la fonction de l'lncRNA est liée aux gènes codant des protéines situés à proximité de ses coordonnées, de sorte que les gènes codant des protéines en position proche de l'lncRNA sont sélectionnés comme ses gènes cibles. Le principe de prédiction des gènes cibles par co-expression suggère que la fonction de l'lncRNA n'est pas liée à la localisation du gène codant, mais à son gène codant des protéines co-exprimé. Les gènes cibles peuvent être prédits par analyse de corrélation ou analyse de co-expression entre l'expression des lncRNAs et des gènes codant des protéines entre les échantillons.
- Comment expliquer que les séquences partielles de lncRNA prédites sont cohérentes avec les séquences d'ARNm ?
- • L'lncRNA de sens n'a pas été retiré de la base de données, l'lncRNA de type sens chevauche en partie l'ARNm.
• Si les positions de l'lncRNA et de l'ARNm sont exactement les mêmes, nous devons considérer s'ils se trouvent respectivement sur les brins positif et négatif. L'lncRNA et l'ARNm peuvent exister sur des brins différents, mais les bases sont complètement complémentaires.
- • L'lncRNA de sens n'a pas été retiré de la base de données, l'lncRNA de type sens chevauche en partie l'ARNm.
- Comment dépister les lncRNA lors de l'analyse des données de séquençage ?
- 1. Fusionner les transcriptions obtenues en épissant tous les échantillons à l'aide du logiciel cuffcompare et sélectionner les transcriptions qui sont identifiées par les deux logiciels d'épissage, ou qui apparaissent dans au moins deux échantillons en même temps.
2. Sélectionnez les transcrits ≥ 200 pb.
3. Filtrer les transcriptions par leurs valeurs FPKM.
4. Si des données de lncRNA connues existent pour l'espèce, les transcrits obtenus à l'étape précédente sont d'abord comparés avec les lncRNA connus à l'aide de cuffcompare pour obtenir des transcrits identiques aux lncRNA connus. Cette fraction de transcrits a été directement intégrée dans l'ensemble final de lncRNA sans dépistage supplémentaire. Ensuite, les transcrits qui sont similaires ou identiques aux transcrits connus ci-dessus sont éliminés en les comparant avec les transcrits de types non-lncRNA et non-mRNA connus (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, pré-miRNA, pseudogènes, etc.) de l'espèce. Si aucune donnée lncRNA connue n'est disponible, une comparaison directe avec les transcrits connus non-lncRNA et non-mRNA de l'espèce est effectuée.
5. Filtrer les lincRNA candidats, les lncRNA introniques, les lncRNA anti-sens et d'autres types pour une analyse quantitative ultérieure en les comparant avec des mRNA connus et en utilisant les informations des résultats de l'analyse cuffcompare.
- 1. Fusionner les transcriptions obtenues en épissant tous les échantillons à l'aide du logiciel cuffcompare et sélectionner les transcriptions qui sont identifiées par les deux logiciels d'épissage, ou qui apparaissent dans au moins deux échantillons en même temps.
- Quelles expériences de validation peuvent être réalisées après le séquençage de l'lncRNA ?
- • Vérification de l'expression : vérifier le niveau d'expression des gènes différentiels par quantification par fluorescence, afin de déterminer s'il est cohérent avec les résultats de séquençage.
• Hybridation in situ (FISH)
• Expérience de perte de fonction : silencer l'lncRNA en utilisant des siRNA, shRNA, acides nucléiques antisens et d'autres méthodes pour observer l'effet de l'intervention sur la valeur ajoutée cellulaire, l'apoptose, l'invasion, la métastase, les chromosomes, etc., et vérifier l'expression des gènes cibles de l'lncRNA.
• Expérience d'acquisition fonctionnelle : construire un vecteur de surexpression de lncRNA, observer l'effet sur la prolifération cellulaire, l'apoptose, l'invasion, etc. après la surexpression de lncRNA, et vérifier l'abondance d'expression des gènes cibles de lncRNA.
• Expériences de surexpression ou de réduction : si l'lncRNA est localisé dans le noyau et que le niveau d'expression des gènes cibles prévus est trouvé élevé après suppression, on suppose que l'lncRNA peut se lier à des facteurs de transcription (protéines) pour inhiber la transcription de l'ADN ; ou si l'lncRNA est localisé dans le cytoplasme et que les expériences de surexpression ou de suppression montrent que certaines activités protéiques sont augmentées ou réduites, on suppose que l'lncRNA peut se lier à certaines protéines et exercer ses effets.
- • Vérification de l'expression : vérifier le niveau d'expression des gènes différentiels par quantification par fluorescence, afin de déterminer s'il est cohérent avec les résultats de séquençage.
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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