Un guide de séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique : de l'expérience en laboratoire à l'analyse des données

Qu'est-ce que la méthylation de l'ADN à cellule unique ?

La méthylation de l'ADN est un marqueur épigénétique hérité lors de la division cellulaire qui affecte la fonction biologique des cellules. Les différences entre les cellules peuvent correspondre à des différences dans les marqueurs épigénétiques, qui à leur tour sont liés à l'expression génique. L'analyse de la méthylation à l'échelle du génome au niveau de la cellule unique fournira des informations sur la régulation transcriptionnelle et l'hétérogénéité cellulaire. Explorer les différences épigénétiques entre les cellules est essentiel pour comprendre l'hétérogénéité des tissus. Les récentes avancées dans le cartographie de la méthylation de l'ADN à cellule unique offrent une opportunité de découvrir cette hétérogénéité.

Comment réaliser le profilage de la méthylation de l'ADN à cellule unique ?

Méthodologie de conversion au bisulfite

La méthode de conversion au bisulfite est considérée comme la référence en matière d'analyse de la méthylation de l'ADN. Elle est privilégiée par les chercheurs en raison de son taux de conversion élevé (>99 %), de sa reproductibilité et de sa simplicité d'utilisation grâce à des kits commerciaux.

Les principales différences entre RRBS et WGBS.

RRBS et WGBS sont des méthodes populaires pour l'analyse de la méthylation à l'échelle du génome. Les deux méthodes incluent la conversion au bisulfite et la préparation pour le séquençage de nouvelle génération (NGS). La principale différence est que RRBS utilise des endonucléases de restriction appropriées et une sélection de taille pour cibler les régions riches en GC. GBS (en particulier MethylC-seq) a l'avantage de pouvoir couvrir la plupart des CpG dans le génome. Le processus de purification et de sélection est relativement simple avec WGBS par rapport à RRBS. Prévenir les pertes de dégradation lors de la transformation au bisulfite dans WGBS est considéré comme relativement important et donc de nombreuses méthodes à cellule unique basées sur WGBS reposent souvent sur PBAT.

scRRBS et scWGBS (Ahn J et al., 2021)

Le flux de travail du RRBS à cellule unique

Le RRBS conventionnel peut être divisé en cinq étapes. La première étape est la digestion de l'ADN avec des endonucléases de restriction, la deuxième étape est la ligation des épissures et son prétraitement, la troisième étape est la sélection des sites riches en GC, la quatrième étape est la transformation au bisulfite et enfin le processus d'amplification avant le séquençage. Ces processus incluent plusieurs étapes de purification, avec une étape d'amplification finale conçue pour compenser les pertes dans les processus précédents. Contrairement au RRBS conventionnel, le RRBS unicellulaire ne garantit pas que l'ADN cible restera intact pendant le processus d'amplification final en raison de la petite quantité d'ADN provenant d'une seule cellule par des méthodes conventionnelles. Par conséquent, le RRBS unicellulaire est affiné en termes de réduction des pertes. Le scRRBS est une méthode qui se concentre sur la minimisation des pertes qui se produisent pendant le processus de purification. La réduction des pertes est obtenue grâce à la digestion par endonucléase de restriction, au processus de ligation des épissures et à la transformation des bisulfites dans un seul tube sans purification.

Le flux de travail de l'analyse génomique à cellule unique (WGAS)

WGBS est le séquençage de méthylation de tout le génome et fournit une couverture génomique plus complète que la méthode RRBS qui ne couvre que les îlots CpG. WGBS est plus simple que RRBS car il ne nécessite pas de digestion enzymatique, de sélection de taille ni d'étapes de macération et de purification des échantillons. Cependant, la perte d'échantillon dans WGBS est principalement due à la conversion au bisulfite. Elle peut également être optimisée par la méthode PBAT.

(a) Aperçu de la méthode de marquage par adaptateur post-bisulfite (PBAT) pour prévenir la perte due à la dégradation pendant le processus de conversion au bisulfite. (b) Aperçu de la réaction en tube unique. (Ahn J et al., 2021)

Méthodologie sans conversion BS

Les méthodes de séquençage de méthylation sans conversion BS se divisent en deux grandes catégories : celles qui exploitent l'affinité de liaison de la méthylcytosine et celles qui exploitent la sensibilité des endonucléases de restriction à la méthylcytosine. Le MBD-seq et le MeDIP-seq sont des méthodes représentatives avec des profils basés sur l'affinité. Les méthodes basées sur l'affinité ne sont pas adaptées à l'application sur le séquençage de cellules uniques car elles reposent sur des fragments d'ADN pour produire un profil moyen de méthylation de l'ADN et ne peuvent donc pas distinguer les différences dans les motifs de méthylation de l'ADN dans des cellules individuelles. Cependant, contrairement aux méthodes basées sur l'affinité, les méthodes basées sur MSRE ont été affinées pour une utilisation dans le séquençage de cellules uniques, et le scCGI-seq mesure la méthylation de manière similaire au Methyl-seq.

Actuellement, la méthode de conversion au bisulfite reste l'un des tests de méthylation les plus courants. Par conséquent, la prochaine présentation sur les méthodes analytiques utilise la méthode de conversion au bisulfite comme exemple.

Analyse des données de séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique

Méthodes d'analyse de la méthylation de l'ADN. (Ahn J et al., 2021)

Évaluation de la qualité des données

Après que des expériences de séquençage, y compris RRBS et WGBS, ont été réalisées, les données de séquençage doivent être prétraitées. Les étapes de prétraitement peuvent être divisées en contrôle de qualité (CQ) des données, découpage des lectures de séquençage et comparaison des lectures de séquençage. La première partie du CQ mesure la qualité globale des données de séquençage de base à l'aide de programmes logiciels tels que FastQC. Après une évaluation approfondie de la qualité des séquences, l'efficacité de conversion du séquençage au bisulfite doit être déterminée. Pour les échantillons avec de faibles taux de conversion en sulfite lourd, il est difficile de distinguer entre les bases séquencées comme cytosines au site CpG et les véritables cytosines méthylées ou les erreurs de séquençage. Cela joue un rôle en tant que facteur de confusion dans l'analyse en aval, y compris la recherche de régions méthylées différemment. L'efficacité de conversion peut être obtenue directement à partir de l'ADN lambda non méthylé ajouté en calculant la proportion de bases converties à la position cytosine ou en utilisant des programmes logiciels disponibles.

Découpage et comparaison de séquences

Le découpage de séquences est effectué à l'aide du logiciel et les séquences lues tronquées sont ensuite comparées au génome de référence, ce qui permet de détecter et de supprimer les appels de bases de faible qualité ou ambigus, ainsi que les séquences d'adaptateurs qui ont pu être introduites lors de la préparation de la bibliothèque.

Analyse de méthylation utilisant le niveau de méthylation

L'objectif principal de l'analyse de méthylation est d'explorer les preuves épigénétiques des différences entre les échantillons constitutifs, les organes et les états pathologiques (y compris le cancer). Afin de découvrir ces différences, une valeur numérique caractérisant ce concept est requise, généralement une valeur bêta, qui est calculée à l'aide de la formule ci-dessous. Après l'appel de méthylation, des analyses ultérieures telles que l'analyse visuelle de t-SNE, l'analyse de clusters et l'identification des cytosines différemment méthylées (DMC) ou des régions différemment méthylées (DMR) sont effectuées.

Analyse de la méthylation utilisant des motifs de méthylation des lectures

Des analyses récentes de méthylation ont utilisé les motifs de méthylation de chaque lecture pour diagnostiquer des maladies, en particulier le cancer. Ce nouveau concept analytique est basé sur la propriété biologique de la méthylation, c'est-à-dire la tendance à maintenir la méthylation entre les sites CpG adjacents, sauf en cas de méthylation ab initio. Cette méthode d'analyse des motifs de lectures est capable de détecter des molécules d'ADN avec des signaux de maladie et a le potentiel d'augmenter les chances de détection de signaux de maladie. Par exemple, une grande étude de biopsie liquide a conçu un classificateur intégré pour classer les types de tumeurs en fonction de l'analyse des motifs de lectures et a montré des résultats significatifs dans la détection des cancers à un stade précoce. De plus, la quantification des molécules d'ADN dérivées de tumeurs par les motifs de méthylation est une autre façon d'évaluer la charge tumorale.

Analyse de la méthylation utilisant des motifs de méthylation des lectures. (Ahn J et al., 2021)

Applications du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique

Recherche sur le développement cellulaire

La maturation des cellules germinales ou des cellules embryonnaires est influencée par l'expression de gènes spécifiques, qui sont corrélés au niveau de méthylation dans l'ADN. Sur la base du profil de méthylation des cellules embryonnaires pré-implantation, par exemple, les mécanismes de méthylation des cellules pré-implantation et ses phénomènes ont été étudiés à l'aide du séquençage de méthylation à cellule unique en suivant des lignées embryonnaires précoces. L'équipe a observé que la méthylation non-CpG s'accumule pendant la maturation des ovocytes, suggérant un rôle différent pour la méthylation non-CpG par rapport à la méthylation CpG pendant la maturation des ovocytes.

Recherche liée aux maladies

Chez les patients atteints de la maladie, le schéma de méthylation de l'ADN diffère de celui des individus en bonne santé. Parmi les différentes maladies, le cancer en particulier présente un schéma de méthylation de l'ADN que les cellules normales n'ont pas, entraînant des différences dans les niveaux d'expression génique. Dans l'étude des cancers avec cette hétérogénéité, une approche multi-omique combinant variation génomique et expression de l'ARN doit être utilisée pour l'analyse. Par exemple, un groupe de recherche a récemment développé une méthode appelée scTrio-seq2, qui intègre les données de séquençage du transcriptome unicellulaire et de méthylation unicellulaire. Plusieurs études ont montré qu'une approche multi-omique utilisant le séquençage de méthylation unicellulaire (sc-methyl-seq) peut surmonter les limitations des méthodes précédentes et fournir une meilleure discrimination. Ainsi, le sc-methyl-seq peut être utilisé dans divers domaines pour répondre à des questions fondamentales liées aux processus biologiques et aux maladies.

Référence

1. Ahn J, Heo S, Lee J, et al. Introduction aux méthodes de profilage de la méthylation de l'ADN à cellule unique[J]. Biomolécules, 2021, 11(7) : 1013.