Extraction d'ADN à partir de tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE)

Extraction d'ADN à partir de tissu FFPE avec un kit d'isolement d'ADN génomique

1. Placez deux à cinq sections de tissu FFPE de 10 μm (d'environ 1 cm² dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
Ajoutez 1000 μl de xylène et vortexez soigneusement pendant 10 secondes (travaillez dans une hotte de protection).
Centrifuger pendant 5 minutes à 20 000 × g.
4. Retirez le surnageant avec précaution et déversez-le dans des conteneurs de déchets spécifiques.
Ajoutez 1000 μl d'éthanol à 99 %.
6. Centrifuger pendant 5 minutes à 20 000 × g.
7. Retirez soigneusement l'éthanol.
Ajoutez à nouveau 1000 μl d'éthanol à 99 % et mélangez délicatement en inversant le tube.
9. Centrifuger pendant 5 minutes à 20 000 × g.
10. Enlevez tout l'éthanol et laissez sécher à l'air le tissu restant en laissant le tube ouvert, puis incubez pendant 10 à 15 minutes à 37 °C dans un bloc thermique.
11. Resuspendre le culot dans 180 μl de tampon ATL.
Ajoutez 20 μl de protéinase K et mélangez par vortexage.
Incuber pendant la nuit à 56 °C.
Incuber à 90 °C pendant 1 h.
Ajoutez 200 μl de tampon AL à l'échantillon et mélangez soigneusement par vortexage.
Ajoutez 200 μl d'éthanol (96–100 %) et mélangez à nouveau soigneusement par vortexage.
17. Continuez avec l'extraction et la purification de l'ADN, avant de commencer les préparations d'échantillons pour l'évaluation de la clonalité.

Extraction d'ADN à partir de tissus FFPE en commençant par la méthode Chelex

1. Sections de tissu déparaffinées de 0 μm jusqu'à l'étape 10.
Ajoutez 200 μl de Chelex-100 à 5% homogènement mélangé dans le tampon de lyse TET.
3. Incuber pendant 5 minutes à 95 °C dans un thermo-agitateur à 350 tr/min.
4. Refroidir pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Ajoutez 20 μl de protéinase K et incubez toute la nuit à 56 °C dans un thermo-agitateur à 350 rpm.
6. Incuber pendant 10 minutes à 95 °C dans un thermo-agitateur à 350 rpm.
7. Centrifuger pendant 10 minutes à 20 000 × g à température ambiante.
8. Transférez le surnageant dans un tube Eppendorf propre de 1,5 ml.
9. Centrifuger pendant 10 minutes à 20 000 × g à température ambiante.
10. Transférez le surnageant dans un tube Eppendorf propre de 1,5 ml.
Ajoutez 180 μl de tampon ATL (QIAamp DNA Micro Kit), vortexez pendant 10 s et incubez à température ambiante pendant 30 min.
12. Incuber à 80 °C pendant 10 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante.
13. Centrifuge brièvement le tube de 1,5 ml pour éliminer les gouttes à l'intérieur du couvercle.
Ajoutez 200 μl de tampon AL et vortexez brièvement.
Incuber à 70 °C pendant 10 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante.
Ajoutez 250 μl d'éthanol à 96 %, puis vortexez brièvement.
17. Poursuivez la procédure avec la purification de l'ADN, avant de commencer les préparations d'échantillons pour l'évaluation de la clonalité.

Purification de l'ADN avec la microcolonne QIAamp ADN

1. Transférez soigneusement l'intégralité du lysat dans la colonne QIAamp MinElute (dans un tube de collecte de 2 ml) et centrifugez à 6000 × g pendant 1 minute.
2. Placez la colonne QIAamp MinElute dans un tube de collecte propre de 2 ml et jetez le tube de collecte contenant le filtrat.
Ajoutez 500 μl de Buffer AW1 sur la colonne et centrifugez à 6000 × g pendant 1 minute.
4. Jetez le liquide de passage et ajoutez 500 μl de tampon AW2 à la colonne.
5. Centrifugez à 6000 × g pendant 1 minute et jetez le liquide de passage.
6. Centrifugez à pleine vitesse (20 000 × g) pendant 3 minutes pour sécher complètement la membrane.
7. Placez la colonne QIAamp MinElute dans un tube Eppendorf propre de 1,5 ml et jetez le tube de collecte contenant le filtrat.
8. Appliquez 20–100 μl de Tampon ATE (Kit QIAamp DNA FFPE) ou 20–100 μl de Tampon AE (Kit QIAamp DNA Micro) au centre de la membrane de la colonne.
9. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
10. Centrifugez à pleine vitesse (20 000 × g) pendant 1 minute.
11. Jetez la colonne et conservez le tube de 1,5 ml contenant la solution d'ADN.
12. Déterminez la concentration en ADN et diluez si nécessaire à une solution de travail de 20 à 40 ng/μl avec le tampon d'élution utilisé ou de l'eau MQ.

Référence :

1. van Bladel D A G, van der Last-Kempkes J L M, Scheijen B, et al. Détection de la clonalité basée sur le séquençage de nouvelle génération des réarrangements des gènes d'immunoglobuline dans le lymphome à cellules B[M]//Immunogénétique. Humana, New York, NY, 2022 : 7-42.