Protocole d'extraction et de contrôle de qualité de l'ADNcf

L'ADN circulant libre de cellules (cfDNA) est un ADN extracellulaire fragmenté, qui est libéré par des cellules apoptotiques et nécrotiques sous forme de petits fragments de <200 pb. L'ADN libre de cellules est généralement isolé à partir du sang ; cependant, il est également possible de détecter le cfDNA dans d'autres fluides biologiques tels que l'urine ou le liquide céphalorachidien. Il a été constaté que l'ADN tumoral circulant (ctDNA) des patients atteints de cancer porte des informations génétiques provenant des cellules tumorales. Ainsi, l'étude de l'ADN circulant aide à résoudre les mutations génomiques dans des maladies spécifiques, telles que divers cancers. Il pourrait être utilisé à l'avenir pour des biopsies non invasives et le suivi de la maladie résiduelle minimale (MRD).

Préparation de l'échantillon

1. Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin à 2000 × g pendant 10 min. Si vous utilisez des tubes EDTA, le temps de traitement ne doit pas dépasser 4 h après le prélèvement de l'échantillon.
2. Déplacer soigneusement les surnageants (plasma) dans un tube de 5 ml avec un fond conique sans endommager la phase de culot.
3. Centrifuger le plasma isolé à 16 000 × g, à 4°C pendant 10 min.
4. Transférer les surnageants dans un tube de 5 ml propre. Procéder immédiatement à l'extraction du cfDNA ou conserver à -80°C.
5. Le cfDNA doit être extrait à partir de 4 ml de plasma sanguin purifié (ajuster les échantillons à 4 ml en ajoutant une solution saline tamponnée au phosphate si le volume est inférieur à 4 ml).

Extraction du cfDNA

1. Avant de commencer l'extraction, les étapes suivantes doivent être effectuées :
(a) Équilibrer les échantillons et les tampons à température ambiante (18–25°C).
(b) Chauffer un bain-marie ou un bloc chauffant à 60°C pour une utilisation avec des tubes de 50 ml.
(c) Chauffer un bloc chauffant à 56°C pour une utilisation avec des tubes Eppendorf de 2 ml.
2. Pipeter 400 μl de protéinase K dans un tube de 50 ml pré-étiqueté.
3. Ajouter 4 ml de plasma dans le tube.
4. Ajouter 3,2 ml de tampon ACL dans le tube. Bien mélanger par vortexage pendant 30 s.
5. Incuber pendant 30 min à 60°C.
6. Ajouter 7,2 ml de tampon ACB et bien mélanger par vortexage pendant 15–30 s.
7. Incuber le mélange pendant 5 min sur de la glace.
8. Insérer un prolongateur de tube de 20 ml dans la colonne ouverte. S'assurer que le prolongateur de tube est fermement inséré dans la colonne pour éviter les fuites de l'échantillon.
9. Verser soigneusement le mélange de l'étape 6 dans le prolongateur de tube. Régler la pompe à vide pour produire un vide de -800 mbar à -900 mbar jusqu'à ce que tous les lysats soient aspirés (cela prend jusqu'à 15 min).
10. Relâcher la pression à 0 mbar, jeter soigneusement les prolongateurs de tube et laisser les colonnes attachées au VacConnector sur le QIAvac 24 Plus.
11. Ajouter 600 μl de tampon de lavage ACW1 à la colonne. Allumer la pompe à vide (-800 mbar à -900 mbar) pendant que le couvercle est ouvert. Après que tout le tampon de lavage a été aspiré à travers la colonne, éteindre la pompe à vide et relâcher la pression à 0 mbar.
12. Ajouter 750 μl de tampon de lavage ACW2 à la colonne. Allumer la pompe à vide (-800 mbar à -900 mbar) pendant que le couvercle est ouvert. Après que tout le tampon de lavage a été aspiré à travers la colonne, éteindre la pompe à vide et relâcher la pression à 0 mbar.
13. Ajouter 750 μl d'éthanol (96–100%) à la colonne. Allumer la pompe à vide (-800 mbar à -900 mbar) pendant que le couvercle est ouvert. Après que tout le tampon de lavage a été aspiré à travers la colonne, éteindre la pompe à vide et relâcher la pression à 0 mbar.
14. Fermer le couvercle de la colonne. Retirer de la manifold à vide et jeter le VacConnector. Déplacer la colonne vers un tube de collecte de 2 ml propre et centrifuger à pleine vitesse (16 000 × g) pendant 3 min.
15. Déplacer la colonne QIAamp Mini vers un nouveau tube de collecte de 2 ml, ouvrir le couvercle et incuber à 56°C pendant 10 min pour sécher complètement la membrane.
16. Déplacer la colonne QIAamp Mini vers un tube d'élution de 1,5 ml propre. Pipeter soigneusement 20–150 μl de tampon AVE sur le filtre de la colonne QIAamp Mini. Fermer le couvercle et incuber à température ambiante pendant 3 min.
17. Centrifuger pendant 1 min à 16 000 × g. Jeter les colonnes.
18. Pour le traitement ultérieur, le cfDNA isolé peut être conservé à 4°C pendant jusqu'à 24 h. Pour un stockage plus long, congeler à <30°C.
19. Utiliser un analyseur de fragments pour mesurer avec précision la taille et la qualité du cfDNA extrait.
20. Après l'extraction, le cfDNA doit être conservé à -80 °C.

Contrôle de qualité du cfDNA par PCR à gouttelettes numériques (ddPCR)

1. Préparer le mélange de réaction en ajoutant 10 μl de ddPCR Supermix 2×, 0,3 μl d'amorce directe (20 μM), 0,3 μl d'amorce inverse (20 μM) et 0,1 μl de sonde (20 μM) à 1 μl d'ADN et compléter avec ddH2O jusqu'à 20 μl.
2. Générer les gouttelettes en pipetant 20 μl d'échantillon dans les puits d'échantillon et 70 μl d'huile de génération de gouttelettes QX200 dans le puits d'huile de la cartouche DG8, couvrir avec les joints DG8 et placer dans le générateur de gouttelettes QX200.
3. Transférer soigneusement 40 μl des gouttelettes générées vers la plaque PCR Twin. tec en pipetant lentement à l'aide d'une pipette multicanaux. Sceller la plaque à l'aide d'un film thermoscellable et d'un scelleur de plaque PCR PX1™.
4. Effectuer la réaction PCR sur un cycler thermique en incubant l'échantillon pendant 10 min à 95°C pour la dénaturation, suivie de 40 cycles d'incubation de 30 s à 94°C pour la dénaturation initiale et 1 min d'incubation à 60°C pour l'hybridation. Appliquer une étape d'extension finale en incubant pendant 10 min à 98°C et stocker l'échantillon à 4°C.
5. Déplacer les plaques vers le lecteur de gouttelettes QX200 pour mesurer les gouttelettes amplifiées.
6. Pour mesurer les fragments amplifiés, commencer une nouvelle expérience dans le logiciel QuantaLife™, ajuster le Supermix à ddPCR™ Supermix sans dUTP pour les puits souhaités, nommer les cibles et sélectionner les canaux appropriés utilisés dans la sonde (FAM, HEX, etc.).
7. Placer la plaque dans le lecteur et exécuter l'expérience, choisir DyeSet : FAM ou FAM/HEX.
8. Enregistrer l'analyse et charger le fichier exporté dans le logiciel Quanta- Soft™ Pro.
9. Définir le seuil dans l'amplitude 1D sur la fraction positive.
10. Exporter les résultats vers Excel ou toute autre application de tableur.
11. Calculer la moyenne des copies/20 μl de lectures et la diviser par 2 pour déterminer le nombre de copies par cellule.
12. Diviser le nombre de copies par cellule par 150 pour calculer la concentration (ng/μl). Calculer la concentration de cfDNA par 1 ml de plasma.
13. Pour la préparation de la bibliothèque, garder les réactifs sur glace jusqu'à utilisation.

Références :

1. Pott C, Kotrova M, Darzentas N, et al. Analyse IG basée sur le cfDNA par NGS dans le lymphome[M]//Immunogénétique. Humana, New York, NY, 2022 : 101-117.
2. Bohers E, Viailly P J, Jardin F. Séquençage du cfDNA : Approches technologiques et problèmes bioinformatiques. Pharmaceuticals, 2021, 14(6) : 596.