Séquençage des récepteurs B avec un protocole de codes-barres moléculaires

Extraction d'ARN

1. Collecte de cellules : Transférez les cellules dans un tube approprié et centrifugez pendant 5 minutes à 300 ×g. Éliminez le surnageant.
2. Homogénéisez et lysez l'échantillon en ajoutant 350 μL de tampon LBP au culot cellulaire. Mélanger les cellules avec un tampon de lyse est généralement suffisant pour une lyse complète.
3. Éliminer l'ADNg et filtrer le lysat : Placez la colonne d'élimination de l'ADNg NucleoSpin® (anneau jaune) dans un tube de collecte de 2 mL, transférez le lysat homogénéisé dans la colonne d'élimination de l'ADNg NucleoSpin®, puis centrifugez pendant 30 s à 11 000 × g. Jetez la colonne et continuez avec le filtrat.
4. Ajustez les conditions de liaison de l'ARN : Ajoutez 100 μL de solution de liaison BS au surnageant, et mélangez bien par vortexage modéré ou en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Après l'ajout de la solution de liaison BS, un précipité filamenteux peut devenir visible, ce qui n'affectera pas l'isolement de l'ARN. Assurez-vous de désagréger tout précipité en mélangeant et chargez tout le précipité sur la colonne comme décrit dans l'étape suivante. Ne centrifugez pas le lysat après l'ajout de la solution de liaison avant de le charger sur la colonne afin d'éviter de peler le précipité.
5. Lier l'ARN : Transférez l'intégralité du lysat (~450 μL) dans la colonne NucleoSpin® RNA Plus (anneau bleu clair) préassemblée avec un tube de collecte. Centrifugez pendant 15 s à 11 000 × g.
6. Laver et sécher la membrane en silice :
(a) Premier lavage : Ajoutez 200 μL de tampon WB1 à la colonne NucleoSpin® RNA Plus. Centrifugez pendant 15 s à 11 000 × g. Jetez le filtrat avec le tube de collecte et placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 mL.
(b) Deuxième lavage : Ajoutez 600 μL de tampon WB2 à la colonne NucleoSpin® RNA Plus. Centrifugez pendant 15 secondes à 11 000 × g. Jetez le liquide de passage et remettez la colonne dans le tube de collecte.
(c) Troisième lavage : Ajoutez 250 μL de tampon WB2 à la colonne NucleoSpin® RNA Plus. Centrifugez pendant 2 minutes à 11 000 × g pour sécher complètement la membrane. Placez la colonne dans un tube de collecte de 1,5 mL sans nucléase.
7. Élué l'ARN : Ajoutez 30 μL d'eau RNase-free et centrifugez à 11 000 × g pendant 1 minute. Ajoutez 30 μL supplémentaires d'eau RNase-free dans la colonne, puis centrifugez à nouveau à 11 000 × g pendant 1 minute.
8. Après l'extraction de l'ARN, si la taille de l'échantillon n'est pas limitée, nous recommandons d'évaluer la qualité de l'ARN total à l'aide du kit Agilent RNA 6000 Pico ou d'une plateforme équivalente. Référez-vous au fabricant pour les instructions.

Synthèse de cDNA de première chaîne

1. Décongeler le tampon de première chaîne à température ambiante. Décongeler l'activateur BCR, les codes-barres moléculaires SMART Oligo et le primer dT sur glace. Vortexer doucement chaque réactif pour bien mélanger et centrifuger brièvement. Conserver tous les réactifs sauf le tampon de première chaîne sur glace. Retirer la transcriptase inverse SMARTScribe et l'inhibiteur d'ARNase du congélateur immédiatement avant utilisation, centrifuger brièvement et conserver sur glace.
2. Préchauffez le cycler thermique à 72 °C.
3. Sur de la glace, préparez des échantillons et des témoins dans des tubes PCR à paroi fine sans nucléase, des plaques ou des bandes en ajoutant les réactifs.
4. Mélangez en vortexant doucement puis centrifugez brièvement.
5. Incubez les tubes à 72 °C dans le thermocycleur à couvercle chauffé préchauffé pendant 3 minutes. Pendant cette incubation, préparez le mélange maître de RT.
6. À température ambiante, préparez le mélange maître RT.
7. Mélangez bien le RT Master Mix en pipetant doucement de haut en bas, puis centrifugez brièvement.
8. Immédiatement après l'incubation de 3 minutes à 72 °C, placez les échantillons sur de la glace pendant 2 minutes.
9. Réduisez la température du cycler thermique à 42 °C.
Ajoutez 7,5 μL du mélange maître RT à chaque tube de réaction. Mélangez le contenu de chaque tube en pipetant doucement et centrifugez brièvement.
11. Placez les tubes dans un cycler thermique avec un couvercle chauffant, préchauffé à 42 °C. Exécutez le programme suivant : 42 °C, 90 min ; 70 °C, 10 s ; maintien à 4 °C.

Amplification de première ronde

1. Décongeler le tampon PrimeSTAR GXL 5×, le mélange de dNTP, les amorces et l'eau sans nucléase sur de la glace. Vortexer doucement chaque réactif pour mélanger et centrifuger brièvement. Conserver sur de la glace. Retirer l'ADN polymérase PrimeSTAR GXL du congélateur juste avant utilisation, pipeter doucement pour mélanger, centrifuger brièvement et conserver sur de la glace.
2. Préparez un mélange maître PCR1 pour chaque chaîne d'IgG/IgM/IgK/IgL d'intérêt, en combinant les éléments suivants dans l'ordre indiqué, sur de la glace. Vortexez doucement pour mélanger et centrifugez brièvement.
Ajoutez 46 μL du mélange maître PCR1 approprié d'IgG/IgM/IgK/IgL dans une plaque/tube PCR de 0,2 mL à paroi fine, sans nucléase.
Ajoutez 4 μL de cDNA de première chaîne provenant de la sous-section 3.3 dans le(s) tube(s) correspondant(s) contenant le mélange maître PCR1. Vortexez doucement pour mélanger, puis centrifugez brièvement.
5. Placez la plaque/tube(s) dans un thermocycleur préchauffé avec un couvercle chauffant, et exécutez le programme suivant (température du couvercle : 105 °C) : 95 °C 1 min ; 98 °C 10 s, 60 °C 15 s, et 68 °C 45 s (18 cycles) ; maintien à 4 °C.

Amplification PCR de deuxième cycle

1. Décongeler le tampon 5X PrimeSTAR GXL, le mélange de dNTP, les amorces et l'eau sans nucléase sur de la glace. Vortexer doucement chaque réactif pour mélanger et centrifuger brièvement. Conserver sur de la glace. Retirer l'ADN polymérase PrimeSTAR GXL du congélateur juste avant utilisation, pipeter doucement pour mélanger, centrifuger brièvement et conserver sur de la glace.
2. Pour chaque chaîne IgG/IgM/IgK/IgL d'intérêt, préparez un mélange maître PCR2 en combinant les éléments suivants dans l'ordre indiqué, sur glace. Vortexez doucement pour mélanger et centrifugez brièvement.
3. Pour chaque réaction, ajoutez 48 μL de Master Mix PCR2 dans une plaque/tube PCR de 0,2 mL à paroi fine, sans nucléase.
Ajoutez 1 μL du produit PCR1 approprié à chaque tube PCR 2 correspondant.
Ajoutez 1 μL du primer hBCR PCR2 Universal Forward 1–12 approprié à chaque échantillon. Vortexez doucement pour mélanger et centrifugez brièvement.
6. Placez la plaque/tube(s) dans un cycler thermique préchauffé avec un couvercle chauffé, et exécutez le programme suivant (température du couvercle : 105 °C) : 95 °C 1 min ; 98 °C 10 s, 60 °C 15 s, 68 °C 45 s (X* cycles) ; 4 °C Maintien.

Purification des bibliothèques amplifiées

1. Vortexez les billes NucleoMag jusqu'à ce qu'elles soient bien mélangées, puis ajoutez 25 μL des billes NucleoMag à chaque échantillon.
2. Mélangez soigneusement en pipetant doucement tout le volume de haut en bas au moins dix fois.
3. Incuber à température ambiante pendant 8 minutes pour permettre à l'ADN de se lier aux billes.
4. Faites tourner brièvement les échantillons pour recueillir le liquide sur le côté du tube ou du puits d'échantillon. Placez les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique pendant environ 5 minutes ou plus jusqu'à ce que le liquide apparaisse complètement clair et qu'il n'y ait plus de billes dans le surnageant. Le temps nécessaire pour que la solution devienne claire dépendra de la force de l'aimant.
5. Pendant que les tubes de réaction reposent sur le dispositif de séparation magnétique, utilisez une pipette pour transférer le surnageant (qui contient votre bibliothèque) dans des tubes PCR propres.
6. Retirez les tubes contenant les billes de l'appareil de séparation magnétique et jetez-les.
Ajoutez 10 μL de billes NucleoMag à chaque tube contenant le surnageant.
8. Mélangez soigneusement en pipetant doucement tout le volume de haut en bas au moins dix fois.
9. Incuber à température ambiante pendant 8 minutes pour permettre à l'ADN de se lier aux billes.
10. Placez les tubes sur le dispositif de séparation magnétique pendant environ 10 minutes ou jusqu'à ce que la solution soit complètement claire.
11. Pendant que les tubes sont sur le dispositif de séparation magnétique, retirez le surnageant avec une pipette et jetez-le.
12. Gardez les tubes sur le dispositif de séparation magnétique. Ajoutez 200 μL d'éthanol à 80 % fraîchement préparé à chaque échantillon, sans perturber les billes, pour éliminer les contaminants. Attendez 30 secondes et utilisez une pipette pour retirer délicatement le surnageant contenant les contaminants. La bibliothèque restera liée aux billes pendant le processus de lavage.
13. Répétez le lavage à l'éthanol (étape 12 de cette section) une fois de plus.
14. Faites tourner brièvement les tubes (~2000 × g) pour rassembler le liquide restant au fond de chaque tube. Placez les tubes sur le dispositif de séparation magnétique pendant 30 s, puis retirez tout le liquide restant à l'aide d'une pipette.
15. Laissez les tubes d'échantillon reposer ouverts sur le dispositif de séparation magnétique à température ambiante pendant environ 2 à 2,5 minutes jusqu'à ce que le culot apparaisse sec et ne soit plus brillant. Vous pourriez voir une petite fissure dans le culot.
16. Une fois que le pellet de billes a séché, retirez les tubes de l'appareil de séparation magnétique et ajoutez 17 μL de tampon d'élution pour couvrir le pellet. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas pour assurer une dispersion complète des billes.
Incubez à température ambiante pendant au moins 5 minutes pour réhydrater.
18. Faites tourner brièvement les échantillons pour recueillir le liquide sur le côté du tube ou du puits d'échantillon. Remettez les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique pendant 2 minutes ou plus jusqu'à ce que la solution soit complètement claire.
19. Transférez le surnageant clair contenant la bibliothèque BCR/IG purifiée de chaque tube dans un tube à faible adhérence et sans nucléase. Étiquetez chaque tube avec les informations sur l'échantillon et conservez à −20 °C.

Séquençage

1. Diluez chaque bibliothèque à 4 nM dans de l'eau sans nucléase. Pour éviter les erreurs de pipetage, utilisez au moins 2 μL de chaque bibliothèque originale pour la dilution.
2. Regroupez les bibliothèques diluées en combinant une quantité égale de chaque bibliothèque dans un tube de 1,5 mL à faible liaison. Mélangez en vortexant à basse vitesse ou en pipetant de haut en bas. Utilisez au moins 2 μL de chaque bibliothèque diluée pour éviter les erreurs de pipetage.
3. Utilisez un aliquote de 5 μL des bibliothèques en pool à une concentration de 4 nM. Suivez le protocole de dénaturation des bibliothèques selon la dernière édition du guide de l'utilisateur de votre instrument de séquençage Illumina.

Référence :

1. Gupta N, Marquez S, Soto C, et al. Séquençage en vrac à partir d'ARNm avec des codes-barres moléculaires pour l'évaluation de l'isotype des cellules B et de l'évolution clonale : une méthode de la communauté AIRR[M]//Immunogénétique. Humana, New York, NY, 2022 : 345-377.