Isolation de l'ARN viral pour le protocole de séquençage de nouvelle génération

Purification partielle d'un virus ARN

1. Placez 25 ml de liquide allantoïque infecté par l'IBV dans un tube Falcon de 50 ml et centrifugez pendant 10 minutes à 1 150 × g, à 4 °C dans une centrifugeuse de paillasse.
2. Prenez le surnageant et déposez-le sur 10 ml de saccharose à 30 % dans un tube d'ultracentrifugation. Équilibrez soigneusement les tubes.
3. Centrifuger pendant 4 h, 102 400 × g, à 4 °C dans une ultracentrifugeuse.
4. Enlevez le surnageant par couches, en veillant à ne pas perturber le culot.
5. Essuyez les côtés du tube avec un tissu et passez directement à l'étape suivante, l'extraction de l'ARN.

Extraction d'ARN

Ajoutez 1 ml de réactif TRIzol directement au culot viral, puis pipettez délicatement de haut en bas pour mélanger.
2. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
3. Ajouter 200 μl de chloroforme et mélanger en secouant pendant 15 s.
4. Incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
5. Centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse pendant 15 min, à 4 °C, 12 075 × g.
6. Prenez soigneusement la couche aqueuse supérieure, qui doit être claire, et placez-la dans un tube propre de 1,5 ml.
Ajoutez 0,5 ml d'isopropanol et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
8. Centrifuger pendant 10 minutes à 2 100 × g, à 4 °C dans une centrifugeuse de paillasse.
9. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
Ajoutez 0,75 m de 75 % d'éthanol au culot et mélangez en pipetant.
11. Centrifuger pendant 10 min, 12 075 × g, 4 °C dans une centrifugeuse de paillasse.
12. Enlevez le surnageant très délicatement et essuyez les parois du tube avec un tissu.
13. Laissez sécher la pellet à l'air pendant 5 à 10 minutes.
14. Resuspendre le culot dans 25 μl d'eau stérile sans RNAase et conserver à −20 ou −80 °C.