Questions et réponses sur la transcriptomique

Questions générales

Quels types de séquençage du transcriptome peuvent être choisis ?

(1) Selon le type d'ARN
Il existe le séquençage de l'ARNm, le séquençage de l'ARN small, le séquençage de l'ARN long non codant, le séquençage de l'ARN circulaire, le séquençage de l'ensemble du transcriptome, etc.
(2) Selon les caractéristiques des espèces
Par exemple, les eucaryotes ou les procaryotes, qu'il y ait un génome de référence, différentes plateformes de séquençage, le séquençage du transcriptome eucaryote avec et sans référence, le séquençage du transcriptome procaryote, le séquençage du transcriptome en pleine longueur, etc.

Comment choisir la taille du volume de données pour le séquençage du transcriptome ?

La quantité de données requise pour le séquençage régulatoire transcriptionnel varie en fonction du type de projet, et la quantité de données est également liée à la taille et à la complexité du génome.
Pour garantir la fiabilité et l'exactitude des résultats d'analyse des données, pour la plateforme Illumina et la plateforme PacBio : un volume de données de 6 Go est recommandé pour le séquençage du transcriptome eucaryote pour les analyses ultérieures, et un volume de données de 8 à 10 Go est recommandé.
Si vous souhaitez détecter des transcrits à faible abondance ; pour le transcriptome prokaryote, un volume de données de 4 Go est recommandé pour les analyses ultérieures ; et pour certains gènes avec un grand nombre d'espèces, des éléments préoccupants avec une faible abondance d'expression génique, et des interactions pathogène-hôte, le volume de données peut être augmenté de manière appropriée en fonction de la situation.

Quelle est la différence entre les bibliothèques de transcriptomes prokaryotes et eucaryotes ?

L'ARNm eucaryote possède une queue poly A et peut être enrichi par du poly dT. De plus, les génomes eucaryotes sont généralement plus grands et ont habituellement des gènes uniquement sur le brin positif, donc la construction de bibliothèques eucaryotes peut être réalisée par enrichissement en poly A.
Les génomes procaryotes ont un taux d'utilisation plus élevé et plus de gènes existent à la fois sur les brins positif et négatif, il est donc nécessaire de faire la distinction entre les informations des brins positif et négatif lors de la construction de bibliothèques procaryotes. Notre méthode de construction de bibliothèques procaryotes est la construction de bibliothèques spécifiques au brin ribosomal.

Processus de construction de bibliothèque routinière du transcriptome d'ARNm ?

Quelle est la relation entre le séquençage du transcriptome et l'expression génique numérique (DEG) ?

Les principales différences entre le transcriptome et les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) sont la stratégie de séquençage, le volume de données et l'analyse des données. Le séquençage du transcriptome a un volume de données plus important et permet une analyse de la structure des gènes en plus de l'analyse des gènes exprimés de manière différentielle. En revanche, le volume de données du séquençage DEG est faible, ce qui signifie généralement qu'il peut satisfaire l'analyse de l'expression génique différentielle mais ne peut pas effectuer d'analyse de la structure des gènes.

La séquençage du transcriptome nécessite-t-il des réplicats biologiques ?

Les organismes individuels sont très différents, et si la taille de l'échantillon est petite, les gènes exprimés différemment obtenus sont susceptibles de n'être que l'expression de quelques différences individuelles, et ne reflètent pas les caractéristiques essentielles d'une maladie ou d'un état physiologique particulier de la population.
Pour les échantillons de plantes et d'animaux, il est recommandé d'avoir plus de 5 répliques biologiques pour effectuer des tests de corrélation entre les échantillons biologiques afin d'améliorer la crédibilité des résultats expérimentaux.
Pour les échantillons cellulaires, la variabilité entre les réplicats biologiques est relativement faible, et plus de 3 réplicats biologiques sont recommandés.
Pour les échantillons d'études cliniques, un plus grand nombre de réplicats biologiques est nécessaire en raison des différences possibles dans le génotype, le mode de vie, l'environnement de vie, l'âge et le sexe des donneurs, et plus de 10 réplicats biologiques sont généralement requis.

Lors du séquençage du transcriptome eucaryote, l'ARN mitochondrial et l'ARN chloroplastique seront-ils détectés ?

Puis-je réaliser une analyse de transcriptome procaryote ou une analyse de transcriptome sans référence lorsque l'espèce n'a pas de génome de référence ?

Dans le cas d'un mauvais génome de référence, devrais-je choisir de séquencer le transcriptome sans ou avec référence ?

Tant que le génome de référence est disponible, il est de préférence recommandé d'utiliser le génome de référence pour l'analyse. La partie la plus difficile pour l'assemblage du génome est la région répétée, et la mauvaise qualité de l'assemblage des gènes est principalement due aux séquences répétées. Les séquences des régions codantes du génome sont relativement faciles à assembler car elles présentent une bonne hétérozygotie ou répétabilité. La qualité de l'assemblage de la région codante est généralement meilleure. Par conséquent, le génome de référence est utilisé de manière préférentielle.

Quels sont les facteurs affectant les résultats du séquençage du transcriptome ?

La dégradation de l'ARN affecte gravement la qualité du séquençage. Après la dégradation de l'ARN, l'ARNm purifié ne peut pas être capturé après l'ajout de poly-A, par conséquent, la transcription inverse avec des amorces aléatoires ne peut pas obtenir tous les cDNAs, entraînant un biais évident de 3'- et 5'- des résultats de séquençage. La présence de polymorphes de poly-A dans la bibliothèque peut interférer avec le signal de séquençage et affecter la précision des résultats de séquençage ; de plus, en raison de l'abondance incohérente des transcrits dans le transcriptome, les échantillons doivent être homogénéisés avant l'expérience, sinon les gènes exprimés en forte abondance masqueront les gènes exprimés en faible abondance, entraînant l'échec de la découverte de nouveaux gènes ou l'obtention d'un grand nombre de séquences dupliquées sans signification.

Pourquoi ai-je besoin de construire une bibliothèque spécifique à un brin ?

De nombreux gènes possèdent des transcriptions d'ARN à polarité positive et négative sur le génome, et la transcription antisens est une caractéristique des gènes eucaryotes et constitue un mode de régulation important. L'utilisation de bibliothèques spécifiques à un brin préserve l'information directionnelle de l'ARN et nous permet de déterminer si les transcriptions proviennent de brins positifs ou négatifs, ce qui nous permet d'obtenir des résultats de caractérisation génétique et des informations sur l'expression génique plus précis.

Préparation des échantillons

Dois-je congeler rapidement mon échantillon cellulaire après avoir ajouté du trizol pour l'extraction d'ARN ?

20 mg de tissu adipeux est-il suffisant pour le transcriptome ?

Le tissu adipeux est un échantillon de tissu avec une faible teneur en acides nucléiques et un faible rendement en ARN. Dans des conditions normales, 1 mg de tissu adipeux ne peut extraire que 0-0,05 μg d'ARN, 20 mg d'échantillon ne peuvent mentionner qu'1 μg d'ARN au maximum si l'échantillon est en bon état et sans tenir compte des pertes d'extraction, tandis que normalement 2 μg d'ARN sont nécessaires pour le séquençage du transcriptome, il est recommandé d'envoyer plus d'échantillons, de préférence au-dessus de 50 mg.

Quelles sont les précautions à prendre lors de la livraison d'échantillons de sang pour le séquençage du transcriptome ?

Il est recommandé d'utiliser des tubes de prélèvement contenant de l'EDTA pour les échantillons de sang total, ou des tubes de prélèvement contenant du citrate de sodium sont également acceptables. Les cellules sanguines peuvent également être centrifugées, mais le sang total et les cellules sanguines doivent être traités avec Trizol. Après congélation instantanée dans de l'azote liquide, conservez à -80°C et transportez sur de la glace sèche.
Pour le sang humain total, il est recommandé d'utiliser des tubes PAXgene pour la collecte, qui peuvent être conservés pendant 3 jours à 18-25°C, 5 jours à 2-8°C et 8 ans à -20 à -80°C. En principe, un stockage à -80°C et un transport sur glace carbonique sont nécessaires.

Qu'est-ce que je dois surveiller lors de la collecte d'échantillons de tissus frais ?

Après l'isolement des échantillons de tissus frais, les enzymes ARN endogènes présentes dans les échantillons dégraderont rapidement l'ARN en peu de temps, et l'apoptose affectera également l'expression des niveaux de transcrits dans les échantillons de tissus frais. Il est donc recommandé d'obtenir les échantillons de tissus frais de manière cryogénique et rapide, de les congeler immédiatement et adéquatement dans de l'azote liquide, de les stocker à -80°C et de les transporter sur de la glace carbonique. Il faut minimiser le temps d'exposition des échantillons de tissus à l'air ambiant pour garantir l'intégrité de l'ARN.

Les échantillons de tissu peuvent-ils être directement stockés sur de la glace sèche pour le séquençage du transcriptome et ce stockage affectera-t-il les résultats du séquençage ?

Quelles sont les choses auxquelles je devrais faire attention lors de la préparation d'échantillons cliniques tels que des échantillons de tumeurs ?

Les échantillons de tumeurs sont très actifs et l'ARN sera presque complètement dégradé en peu de temps dans des conditions de température ambiante. Il est donc recommandé d'obtenir les échantillons de tumeurs à basse température et rapidement, de les congeler immédiatement et correctement dans de l'azote liquide, de les stocker à -80°C et de les transporter sur de la glace sèche. Minimisez le temps d'exposition des échantillons de tissu à l'air à température ambiante pour garantir l'intégrité de l'ARN (pour des exigences de livraison spécifiques, veuillez vous référer à nos directives de livraison de transcriptome).

Puis-je utiliser de la trypsine pour digérer des cellules à paroi pour l'ARN-seq et collecter des échantillons ?

1. Retirez les cellules cultivées adhérentes de l'incubateur, observez les cellules au microscope pour déterminer leur bon état de croissance et jetez le milieu.
2. Ajouter 1×PBS préparé avec le même volume d'eau sans enzyme que le milieu, laver les cellules pendant 1 minute, puis jeter le PBS et répéter une fois.
3. Ajoutez la quantité appropriée de solution de lyse en soufflant à plusieurs reprises jusqu'à ce que tout soit lysé (Trizol, par exemple, pour une plaque de 10-15 cm, en ajoutant à chaque fois 1-2 mL, en soufflant et en mélangeant. Le critère pour une lyse adéquate est que le liquide ne soit pas visqueux lors du soufflage, avec une bonne fluidité. Si le liquide est trop visqueux, cela signifie que la lyse n'est pas suffisante et qu'il faut ajouter de la solution de lyse.)
4. Après le transfert dans un tube de lyophilisation à bouche filetée résistant à -192°C, réfrigérateur à -80°C pour un stockage à long terme, transport sur glace carbonique.
(Note : Essayez de ne pas utiliser la digestion par la trypsine, la trypsine est plus une expérience de fonctionnement de test, une mauvaise opération fera éclater les cellules.)

Spécimen pour l'ARNm, l'échantillon a été précipité dans de l'isopropanol, peut-il être envoyé directement ou devrais-je récupérer l'ARN puis envoyer l'échantillon ?

Puis-je réaliser un transcriptome général avec des échantillons de sections de paraffine ?