Le flux de travail de la métagénomique virale

Comment fonctionne la métagénomique virale ?

Comme tout le monde le sait, la plupart des virus infectent les microorganismes, les plantes et les animaux. Ils causent des maladies infectieuses familières (comme la grippe et les verrues) et même certaines maladies graves telles que la variole, Ebola et le VIH/SIDA. Étant donné que moins d'un pour cent des hôtes microbiens ont été cultivés, il est très important d'identifier et de mesurer la dynamique communautaire des virus dans l'environnement. Contrairement aux bactéries et aux champignons, il n'existe pas de gènes évolutivement conservés, il n'est donc pas possible de surveiller la diversité virale en utilisant des approches analogues à Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS. Métagénomique virale peut fournir des informations sur la composition et la structure des communautés virales.

Le flux de travail de la métagénomique virale comprend la collecte d'échantillons, la purification des particules virales, l'extraction des acides nucléiques, la préparation des bibliothèques, et séquençage métagénomiqueC'est similaire au flux de travail de la métagénomique, mais ils diffèrent à certaines étapes. Tout d'abord, il est essentiel d'enrichir les virions. Deuxièmement, pour les virus à ARN, les ARN viraux doivent être convertis en cDNA.

Figure 1. Diagramme de flux pour l'analyse métagénomique des virus (Cholleti et al. 2018).

Étapes de purification des particules virales dans la métagénomique virale

Il est compliqué d'isoler l'ADN communautaire représentatif en présence d'ADN libre et cellulaire. La taille moyenne du génome viral (~50 kb) est environ 50 fois plus petite que celle du génome microbien moyen (~2,5 Mb). Ainsi, le signal de l'ADN viral sera noyé par la contamination cellulaire si l'ADN libre n'est pas éliminé. Ici, nous prenons des échantillons d'eaux usées et cliniques comme exemples pour introduire comment enrichir les virions.

Échantillon d'eaux uséesInitialement, 25 mL de tampon glycine (0,05 M de glycine, 3 % d'extrait de viande, pH 9,6) est ajouté à 200 mL d'eaux usées et mélangé, afin de détacher les particules virales liées à la matière organique. L'échantillon est ensuite centrifugé à 8 000×g pendant 30 minutes. Le surnageant est collecté et filtré à travers une membrane en polyéthersulfone (PES) de 0,45 μm pour éliminer les cellules procaryotes et eucaryotes. Les virus sont précipités à partir du surnageant par incubation avec du PEG 8000 (80 g/L) et du NaCl (17,5 g/L) pendant agitation (100 rpm) toute la nuit à 4˚C, suivie d'une centrifugation pendant 90 minutes à 13 000×g. Le culot contenant les virus résultant est éluté dans 1 mL de tampon phosphate saline (PBS) et conservé à -80˚C avant un traitement ultérieur.

Échantillon cliniqueAvant la purification des particules virales, il est nécessaire de préparer un homogénat de tissu. Pour l'homogénéisation, un petit cube de tissu (environ 0,5-1 cm3) est placé dans un tube à vis stérilisé contenant 1 mL de tampon PBS et 20-30 billes en céramique stériles. Le tissu est disrupté en secouant 4 fois à la vitesse maximale par intervalles de 15 s à l'aide de l'instrument FastPrep-24. La durée de cette procédure était d'environ 0,5 h. Kohl et al. (2015) ont décrit plus d'informations sur la purification des virus dans des échantillons cliniques (Figure 2).

Figure 2. Description schématique du protocole d'enrichissement universel des virus basé sur des données cliniques pour la métagénomique virale (Kohl et al. 2015).

Après la purification des particules virales, tous les concentrés viraux sont traités avec de la DNase I et de la RNase à 37°C pendant 15 minutes pour éliminer l'acide nucléique extracellulaire, puis les enzymes sont inactivées à 70°C pendant 5 minutes.

Extraction de l'acide nucléique viral en métagénomique virale

Dans la méthode traditionnelle, une fois que les virions sont isolés, le métagénome viral est ensuite extrait et cloné. Le clonage de métagénomes viraux représentatifs reste un défi, en raison de faibles concentrations d'acides nucléiques (~10-17 g d'ADN par virion), d'ADN modifié et de la présence de gènes viraux létaux tels que les lysozymes et les holines. Pour résoudre ce problème, Edwards et al. (2005) ont développé une solution. Tout d'abord, il est nécessaire d'obtenir suffisamment de virions pour le clonage. Ensuite, la technique de bibliothèque de tir aléatoire amplifiée par linker (LASL) permet de cloner de petites quantités d'ADN et de convertir l'ADN modifié en ADN non modifié via une étape d'amplification PCR. Une étape de fragmentation perturbe ensuite les gènes viraux létaux en fragmentant l'ADN en petits morceaux (~2 kb). Il est ainsi possible de réaliser des représentations. métagénomique bibliothèques.

De nos jours, il existe de nombreux excellents kits pour la préparation des acides nucléiques viraux, tels que QIA (Qiagen), NUC (Macherey-Nagel), MIN (BioMerieux) et POW (MO BIO). Pour les virus à ARN, l'ARN doit être converti en ADNc. Alternativement, le génome viral à ARN peut être purifié avec le réactif TRIzol-LS® et le génome viral à ADN peut être purifié par extraction phénolique à partir de particules virales purifiées. La concentration de l'ADN/ARN viral purifié doit être quantifiée à l'aide des technologies RiboGreen® ou PicoGreen®. Si la quantité d'acide nucléique n'est pas suffisante pour une analyse ultérieure, l'amplification de l'ADN/ADNc peut être réalisée en utilisant un kit d'amplification du génome entier/transcriptome.

Séquençage métagénomique et analyse bioinformatique en métagénomique virale

NGS La préparation de la bibliothèque est effectuée à l'aide de kits appropriés qui dépendent de la plateforme de séquençage choisie. Les plateformes courantes pour séquençage métagénomique viral inclure Illumina MiSeq et HiSeq, PacBio RS II, etc. Les bases bioinformatique pipeline pour métagénomique virale inclure le contrôle de qualité (identification et suppression des doublons de séquence et des bases de mauvaise qualité), le mapping du génome hôte (en utilisant plusieurs outils d'alignement de courtes lectures tels que SOAP2, BWA et Bowtie2), et la classification taxonomique des séquences virales.

Figure 3. L'analyse informatique de base de la métagénomique virale (Cholleti et al. 2018).

Références :

1. Cholleti H, Berg M, Hayer J, et al. Virus transmis par des vecteurs et leur détection par métagénomique virale. Écologie des infections et épidémiologie, 2018, 8(1) : 1553465.
2. Hjelmsø M H, Hellmér M, Fernandez-Cassi X, et al. Évaluation des méthodes de concentration et d'extraction des virus à partir des eaux usées dans le contexte du séquençage métagénomique. PLoS One, 2017, 12(1) : e0170199.
3. Kohl C, Brinkmann A, Dabrowski P W, et al. Protocole pour la détection virale métagénomique dans des échantillons cliniques. Maladies infectieuses émergentes, 2015, 21(1) : 48.
4. Parras-Moltó M, López-Bueno A. Méthodes d'enrichissement et de séquençage des assemblages viraux buccaux : viromes de la salive, de la muqueuse buccale et de la plaque dentaire // Le Virome Humain. Humana Press, New York, NY, 2018 : 143-161.