Aperçu du séquençage métatranscriptomique : principes, flux de travail et applications

Qu'est-ce que le séquençage métatranscriptomique ?

Séquençage métatranscriptomique fournit un accès direct à des informations sur le transcriptome microbien cultivable et non cultivable par séquençage à grande échelle et à haut débit des transcrits provenant de toutes les communautés microbiennes dans des échantillons environnementaux spécifiques. Le séquençage métatranscriptomique offre une opportunité de séquencer aléatoirement les ARNm en tant qu'unité pour comprendre la régulation de processus complexes dans les communautés microbiennes. L'étude du métatranscriptome à travers des techniques de séquençage de nouvelle génération nous permet d'obtenir des profils d'expression génique à partir de populations microscopiques entières, fournissant de nouvelles perspectives sur des systèmes biologiques peu connus et surmontant les limitations techniques liées à l'isolement de bactéries individuelles.

Défis du séquençage métatranscriptomique

Bien que les techniques métatranscriptomiques actuelles soient prometteuses, plusieurs obstacles limitent encore leur application à grande échelle. Tout d'abord, une grande partie de l'ARN récolté provient de l'ARN ribosomal (rRNA), et son abondance dominante peut réduire considérablement la couverture de l'ARNm, qui est le principal objectif des études transcriptomiques. Pour surmonter cela, des efforts ont été faits pour éliminer efficacement le rRNA. Deuxièmement, l'ARNm est notoirement instable, compromettant l'intégrité de l'échantillon avant le séquençage. Troisièmement, différencier l'ARN hôte de l'ARN microbien peut être un défi, bien que des kits d'enrichissement commerciaux soient disponibles. Cela peut également être fait. in silico si un génome de référence est disponible pour l'hôte, comme dans le travail de Perez-Losada et al.. qui a considéré l'impact des interactions hôte-pathogène sur le microbiome des voies respiratoires humaines. Enfin, les bases de données de référence du transcriptome sont limitées par leur couverture.

Flux de travail du séquençage métatranscriptomique

Le flux de travail général pour le séquençage métatranscriptomique est illustré dans la Figure 1. Pour simplifier, la première étape consiste à extraire l'ARN total de l'échantillon, puis à le détecter. L'ARN qualifié est soumis à un dépistage des fragments, à la construction d'une base de données et à des tests de qualité correspondants. La bibliothèque qualifiée sera séquencée (principalement en utilisant la plateforme de séquençage Illumina). Les données brutes obtenues par séquençage seront utilisées pour l'analyse bioinformatique.

Figure 1. Un flux de travail typique du séquençage métatranscriptomique (Peimbert M, et al.. 2016)

Le processus de préparation de la bibliothèque de métatranscriptomique est illustré dans la figure 2. Les deux principales stratégies d'enrichissement en ARNm sont présentées, soit par séparation des ARNr grâce à l'hybridation avec des sondes d'ARNr 16S et 23S, soit par déplétion des ARNr par l'intermédiaire d'une exonucléase 5. Ensuite, le premier brin d'ADNc est synthétisé par une transcriptase inverse utilisant des hexamères aléatoires. Le deuxième brin d'ADNc est synthétisé par une ADN polymérase. Enfin, des adaptateurs de séquençage sont attachés aux brins d'ADNc, ce qui peut se faire soit par PCR, soit par ligature.

Figure 2. Le processus de préparation de la bibliothèque de séquençage métatranscriptomique (Peimbert M, et al.. 2016)

Le processus global de bioinformatique de séquençage métatranscriptomique est illustré dans la Figure 3. Les principales étapes sont : filtrer les lectures, sélectionner la bibliothèque entre l'alignement de la séquence de référence et l'exécution. de novo assemblage, annotation, analyse statistique et téléchargement des ensembles de données originaux, assemblés et annotés.

Figure 3. Le processus global de bioinformatique du séquençage métatranscriptomique (Peimbert M, et al.. 2016)

Les applications de la métatranscriptomique

• Santé humaine

Les bactéries symbiotiques (flore normale) jouent un rôle clé dans notre protection contre les agents pathogènes, mais dans certaines conditions, elles peuvent surmonter les réponses protectrices de l'hôte et déclencher des effets pathologiques. L'analyse de la population microbienne peut être utilisée comme un indicateur de l'état de santé d'un individu et comme un outil puissant pour la prévention, le diagnostic et le traitement de maladies spécifiques.

• Évaluation des interactions microbiome-immune

Les effets du microbiote sur le système immunitaire mucosal sont considérés comme essentiels pour influencer la physiologie de l'hôte. Une étude sur des souris knockout (KO) du récepteur de type Toll 5 (TLR5) est un exemple intéressant de l'utilisation de la métatranscriptomique pour compléter caractérisation métagénomique et Profilage du gène 16S rRNA de cette interaction immunitaire microbienne. L'analyse métatranscriptomique a montré que l'expression des gènes liés au moteur flagellaire était régulée à la hausse chez les souris TLR5KO par rapport aux souris de type sauvage. Dans ce modèle, la reconnaissance de la flagelline par TLR 5 entraîne la production d'anticorps anti-flagelline, ce qui entraîne une régulation à la baisse de divers gènes du moteur flagellaire bactérien, inhibant ainsi la microflore. La suppression de TLR 5 entraîne une réduction de la production d'anticorps anti-flagelline, ce qui conduit à une régulation à la hausse des gènes du moteur flagellaire bactérien, augmentant ainsi la capacité des bactéries dans l'environnement gastro-intestinal à perturber la barrière muqueuse.

• Étudier les petits ARN non codants du microbiome

Le transcriptome bactérien comprend de petits ARN non codants (sARN), qui mesurent généralement entre 50 et 500 pb et sont impliqués dans la régulation des gènes. Ils régulent la traduction ou la stabilité du transcrit en interagissant avec la région 5'-non traduite (UTR) de la séquence d'ARNm cible. Ils sont importants pour leur capacité à réguler des processus essentiels chez les bactéries, tels que le métabolisme du fer, la virulence et la détection de quorum, et à s'adapter rapidement aux environnements changeants. L'émergence des méthodes de séquençage de nouvelle génération a accéléré leur identification dans diverses bactéries, telles que Salmonelle et Bacillus subtilisLes méthodes de séquençage de nouvelle génération offrent également une opportunité d'étudier les sARN bactériens au niveau communautaire. Par exemple, l'analyse métatranscriptomique des bactéries provenant de différentes profondeurs de l'océan suggère que les sARN jouent un rôle potentiel dans l'adaptation aux niches. La métatranscriptomique de la microflore intestinale liée à l'activité humaine a identifié un certain nombre de sARN, bien que leur rôle dans la microflore intestinale n'ait pas encore été élucidé.

• Découverte de médicaments

Des centaines de médicaments utilisés aujourd'hui sont dérivés de composés bactériens. L'étude des métagénomes ou des métatranscriptomes dans les communautés microbiennes offre de nouvelles opportunités pour explorer des sources innovantes pour la découverte de médicaments qui sont inaccessibles aujourd'hui en raison des limitations techniques dans l'isolement de ces microorganismes non cultivables.

• Agriculture

Les communautés microbiennes vivant sur et autour des plantes jouent un rôle essentiel dans les nutriments nécessaires à la croissance des plantes. De plus, la présence de micro-communautés spécifiques rend les cultures saines et productives. La métagénomique et la métatranscriptomique offrent une opportunité d'explorer comment les populations microbiennes du sol produisent des cultures plus saines et à plus haut rendement.

• Écologie

Les micro-organismes sont capables d'éliminer une grande variété de substances nocives naturelles et synthétiques et de les convertir en d'autres composés inoffensifs pour les humains et l'environnement. Je ne sais pas comment ces communautés microbiennes dégradent les produits chimiques nocifs, mais cela offre de nouvelles solutions pour réparer et surveiller la pollution environnementale ou améliorer les méthodes de purification de l'eau potable.

• Industrie alimentaire

Les méthodes de métagénomique et de métatranscriptomique peuvent être utilisées pour améliorer la qualité, la fonction et la sécurité des aliments, et fournir des informations liées aux activités métaboliques des communautés microbiennes.

Chez CD Genomics, nous vous offrons des services de séquençage de haute qualité et intégrés. bioinformatique analyse pour votre métatranscriptomique projet. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références :

1. Peimbert M, Alcaraz L D. Un guide du voyageur pour le séquençage métatranscriptomique [M]// Directives de terrain pour les conceptions expérimentales génétiques en séquençage à haut débit. Springer International Publishing, 2016.
2. Vanessa A P, Huang W, Victoria S U, et al.Métagénomique, séquençage métatranscriptomique et approches métabolomiques pour l'analyse du microbiome : [J]. Bioinformatique évolutive en ligne, 2016, 12(Suppl 1):5-16.
3. Dick G. Séquençage métatranscriptomique [M]// Approches génomiques en sciences de la Terre et de l'environnement Maurice C F, Haiser H J, Turnbaugh P J. Les xénobiotiques façonnent la physiologie et l'expression génique du microbiome intestinal humain actif[J]. Cellule, 2013, 152(1-2):39-50.
4. Warnecke F, Hess M. Une perspective : La métatranscriptomique comme outil pour la découverte de nouveaux biocatalyseurs[J]. Journal de biotechnologie, 2009, 142(1):91-95.
5. Jorth P, Turner K H, Gumus P, et al.Métatranscriptomique du microbiome oral humain pendant la santé et la maladie[J]. Mbio, 2014, 5(2) : e01012.
6. O’Malley M A. Métatranscriptomique[M]. Springer New York, 2013.
7. Cao Y, Fanning S, Proos S, et al.Une revue sur les applications des technologies de séquençage de nouvelle génération appliquées aux études sur le microbiome lié à l'alimentation : [J]. Frontières en microbiologie, 2017, 8:1829.
8. Bashiardes S, Zilberman-Schapira G, Elinav E. Utilisation de la métatranscriptomique dans la recherche sur le microbiome[J]. Bioinformatique et Perspectives en Biologie, 2016, 10(10):19-25.